水楊酸誘導紫楠對炭疽病的抗性

侯盼盼，陳安良，費莉玢，馬良進

（浙江農林大學 林業與生物技術學院 生物農藥高效制備技術國家地方聯合工程實驗室，浙江 杭州 311300）

楠木自古以來被譽為江南四大名木之首，國家二級保護植物，主要包括樟科Lauraceae潤楠屬Machilus和楨楠屬Phoebe植物，多為高大喬木，樹干通直，樹型優美，且具有驅蟲等功效，深受人們喜愛，是中國重要的景觀樹種和經濟樹種[1-2]。炭疽病是近年來危害楠木健康的主要病害之一，侵染葉片邊緣、葉尖，病斑呈灰褐色至暗褐色，枝部感染處為黑褐色，病健交界處明顯。此前學者在廣西南寧市良鳳江國家森林苗圃基地和博白縣林業科學研究所，以及廣東省肇慶市北嶺山珍貴樹種種植基地調查發現該病害發生嚴重[3-4]。目前，關于楠木炭疽病防治研究相對較少，且僅限于病原菌鑒定及其發病規律，植物誘導抗性用于楠木病害防治未見報道。化學防治是林業病害防治中最快速、有效的方法。然而，重復使用化學殺菌劑已經導致許多問題，如抗藥性、環境污染、化學殘留等。植物抗病性是利用植物自身的免疫性來對抗病原物的侵染，是近年來的研究熱點。很多研究證明通過天然或化學合成物等可以誘導植物產生抗性，抵抗病原物入侵，從而達到防治效果。水楊酸(SA)是一種內源性激發子，是信號傳導系統中的重要組成部分，參與調控植物生理生化等過程[5-6]。水楊酸可以誘導植物局部獲得性抗性和系統獲得性抗性(SAR)[7-9]，在1979年對感染花葉病毒(TMV)的煙草Nicotiana tabacum栽培種Xanthi-NC研究中首次證明[10]，隨后人們通過大量實驗對水楊酸可以提高植物的抗病性加以驗證，如山茶Camellia japonica灰斑病[11]、桉樹Eucalyptus焦枯病[12]、油茶C.oleifera炭疽病[13]等。本研究分析了SA對楠木炭疽病的誘導抗性，測定可溶性蛋白質、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)的變化來探究其作用機理，旨在為病害防治提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

紫楠Phoebe sheareri又名紫金楠、金絲楠等，由建德市欣林林木服務中心提供，為2年生盆栽苗。供試菌株膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides由浙江農林大學森林保護學科菌種儲存室提供。

1.2 不同質量濃度SA誘導效果測定

1.2.1 不同質量濃度SA誘導對楠木炭疽病病斑大小的影響 配制質量濃度為500、200、100、50 mg·L-1水楊酸溶液(pH 6.8)進行噴霧試驗，約30 mL·株-1，1 d后重復噴灑，并設置無菌水對照。5 d后采集葉片，選擇心葉下完全展開的功能葉片，用滅菌剪刀取樣，樣品成熟度保持一致。每處理3株，4次重復。采用孢子懸浮液進行離體刺傷接種，以不刺穿葉片為宜。于25 ℃下12 h光照12 h黑暗保濕培養，7 d后統計葉片發病情況，采用網格法測病斑面積，重復3次取平均值，計算病斑減小率。病斑減小率=(對照處理病斑面積-誘導處理病斑面積)/對照處理病斑面積×100%

1.2.2 不同質量濃度SA誘導與楠木生理指標變化測定 選取長勢良好大小一致的2年生紫楠植株，配置SA的最終質量濃度為500、200、100、50 mg·L-1，均勻噴灑于植株上，以溶液布滿葉片不流下為宜。以無菌水噴灑作為對照，1 d后重復噴灑，使植物充分吸收，5 d后采集長勢均一的成熟葉片進行生理測定，包括可溶性蛋白質、SOD、POD、CAT，每處理3次重復。可溶性蛋白質采用紫外吸收法測定[14]。取紫楠 葉片0.5 g，按照1∶9的體積比加 入9倍體 積0.1 mol·L-1磷 酸緩沖液(pH 7)，5 000 r·min-1離心10 min，上清液為蛋白質提取液。取蛋白質原液0.5 mL稀釋至5 mL，利用紫外分光光度計測取280 nm及260 nm處的光密度D(280)和D(260)，以pH=7.0磷酸緩沖液進行空白調0。蛋白質質量濃度(g·L-1)=1.45×D(280)-0.74×D(260)。其中1.45和0.74為校正值。SOD活性測定：本研究通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應系統產生超氧陰離子自由基，氧化羥胺形成子糾纏亞硝酸鹽，在顯色劑的反應下呈現紫紅色，根據南京建成生物工程研究所測試盒步驟進行測定，用可見光分光光度計測其光密度。組織中SOD活力定義：每克組織在1 mL反應液中SOD抑制率達50%時所對應的SOD量為1個活力單位(1 U=16.67 nkat)。SOD活力(16.67 nkat·g-1)=[(對照光密度-測定光密度)÷對照光密度]÷50%×反應液總體積(mL)÷取樣量(mL)÷勻漿液濃度(kg·L-1)。CAT活性測定：CAT分解過氧化氫(H2O2)的反應可通過加入鉬酸銨而迅速中止，剩余的H2O2與鉬酸銨作用產生一種淡黃色的絡合物，按照南京建成生物工程研究所測試盒處理結果在405 nm處測定其變化量，可計算出CAT的活力。CAT活力定義：每毫克組織蛋白每秒種分解1 μmol的H2O2的量為1個活力單位。CAT活力(16.67 nkat·g-1)=(對照光密度-測定光密度)×271÷60÷取樣量(mL)÷勻漿液濃度(kg·L-1)。POD活性測定：過氧化氫酶可催化過氧化氫反應，根據南京建成生物工程研究所測試盒測定420 nm處可見光光密度變化來計算酶活性。組織中POD活力定義：在37 ℃條件下，每毫克組織蛋白每分鐘催化1 μg底物的酶量定義為一個活力單位(1 U=16.67 nkat)。POD活力(16.67 nkat·g-1)=[(對照光密度-測定光密度)÷(12×1 cm比色光徑)]×反應液總體積(mL)÷取樣量(mL)÷反應時間(30 min)÷勻漿液濃度(kg·L-1)×1 000。

1.2.3 不同質量濃度SA對孢子萌發率的影響測定 為確定SA對孢子萌發是否有影響，配置含SA的最終質量濃度為0、50、100、200、500 mg·L-1的楠木炭疽病病原菌孢子懸浮液，采用凹玻片萌發法[14]，調節pH至6.8進行25 ℃全黑暗保濕培養，每處理3次重復，12 h后觀察孢子萌發情況，計算孢子萌發率。孢子萌發率=已萌發孢子數/觀察孢子總數×100%；

1.3 SA處理和炭疽病接種后楠木生理指標變化測定

根據質量濃度誘導結果，選用最適宜質量濃度SA進行噴霧處理，1 d后重復噴施，對照為等量無菌水。本實驗共設置4個處理：在第2次SA處理2 h后活體接種(A)；SA處理不接種(B)；無菌水處理并接種(C)；無菌水處理不接種(ck)。每處理3株，4次重復。采用孢子懸浮液針刺接種，脫脂棉保濕處理。不同處理在第2次SA或無菌水噴施后1、2、3、5、7、10、15 d采集生長狀況一致的葉片，于-80 ℃冰箱保存備用，進行后續生理指標變化測定。

2 結果與分析

2.1 不同質量濃度SA對紫楠的誘導效果

2.1.1 對病斑大小的影響 由圖1可以看出：不同質量濃度的SA對紫楠均具有誘導作用，對病斑抑制效果差異顯著(P＜0.05)。與無菌水噴灑處理相比SA質量濃度為100 mg·L-1誘導植物葉片病斑減小率最高，達64.28%，其次是50和200 mg·L-1，誘導效果為59.8%、56.72%，500 mg·L-1誘導效果最差，其中各質量濃度誘導植物病斑大小差異顯著。

2.1.2 對楠木炭疽病孢子萌發的影響 結果表明(圖1)：低質量濃度SA處理孢子萌發率與對照相比無顯著差異，即對孢子萌發無明顯抑制作用，當SA質量濃度為200、500 mg·L-1時抑制作用顯著(P＜0.05)，分別為69.58%和34.75%，同低質量濃度相比差異較大。

圖1 不同質量濃度SA處理對病斑大小及孢子萌發的影響Figure 1 Effect of different concentrations of SA treatment on lesion size and spore germination

2.1.3 對可溶性蛋白質的影響 從圖2可以看出：不同質量濃度SA均可誘導可溶性蛋白質的增加(P＜0.05)，100 mg·L-1所誘導的蛋白質質量濃度是對照的2.11倍，50和200 mg·L-1的誘導效果差異不顯著，與對照相比差異顯著，分別是對照的1.77和1.69倍。500 mg·L-1SA誘導后，可溶性蛋白質質量濃度較其他處理低，但顯著高于對照(P＜0.05)。

2.1.4 對SOD的影響 SOD是植物體內重要的抗氧化酶，SA施用后引起植株SOD活性升高(圖2)。其中500和200 mg·L-1與對照之間無顯著差異，SA質量濃度為100 mg·L-1時酶活性高于50 mg·L-1時的酶活性，差異顯著(P＜0.05)。表明不同質量濃度SA對植物中SOD酶活性的影響不同。

2.1.5 對CAT的影響 CAT活性隨SA質量濃度的上升表現出先升高后降低的趨勢(圖2)，500 mg· L-1質量濃度處理與對照的CAT相比無顯著差異，200、100、50 mg·L-1處理差異顯著(P＜0.05)，均能使CAT活性增加。其中100 mg·L-1的SA處理對楠木植株CAT活性誘導效果最好，是對照的2.03倍。

圖2 不同質量濃度SA處理對可溶性蛋白質、SOD、CAT和POD的影響Figure 2 Effect of different concentrations of SA treatment on soluble protein, SOD, CAT and POD

2.1.6 對POD的影響 不同質量濃度SA處理對POD活性的影響與CAT趨勢相似(圖2)，均為隨SA質量濃度的增加表現為先上升后下降。100 mg·L-1SA誘導的POD活性最高，是對照的1.3倍。200和50 mg·L-1誘導的CAT活性無顯著差異，但顯著高于500 mg·L-1和對照處理。不同質量濃度SA均可引起POD活性增加。上述研究表明：不同質量濃度SA對楠木誘導效果均存在差異，500 mg·L-1誘導效果最差，100 mg·L-1誘導效果最好，因此選擇100 mg·L-1的SA進行下一步實驗。

2.2 SA處理和炭疽病接種引起的楠木生理指標變化

2.2.1 對可溶性蛋白質的影響 從圖3可以看出：不同處理均可引起紫楠葉片可溶性蛋白質質量濃度的增加。SA處理后其蛋白質質量濃度在1～5 d持續增加，5 d時達峰值，處理A在第7天達峰值，隨后下降，可溶性蛋白質質量濃度顯著高于未經SA處理過的處理C和ck。處理A效果最好，第7天時是ck的2.57倍，經SA處理過的植株第15天可溶性蛋白質質量濃度仍顯著高于對照，處理C在第1～3天升高隨后下降，趨勢相較于A處理和B處理趨勢較為平緩。15 d時SA處理過的植株可溶性蛋白質質量濃度顯著高于對照，因此SA可以誘導紫楠植株可溶性蛋白質增加。

2.2.2 對SOD的影響 本研究SA處理均可引起紫楠葉片SOD活性增加(圖3)，隨SA的作用時間先逐漸升高后緩慢下降。當SA作用時間為7 d時，處理A的SOD活性達最大值，是ck的1.21倍，之后開始下降，處理A和處理B的SOD活性始終顯著高于處理C和ck。

2.2.3 對CAT的影響 SA誘導后可引起紫楠體內CAT活性增加(圖3)，有利于增強植株抗病性。紫楠葉片經SA處理和接種處理后，CAT活性在第5天達到峰值，處理A是ck的2.04倍，處理B是ck的1.63倍，5 d后CAT活性下降。處理C的CAT活性雖有增加但到后期與ck相比差異不顯著。

2.2.4 對POD的影響 100 mg·L-1的SA誘導后，植株POD活性迅速升高(圖3)，處理A與處理B的POD活性具有基本相似的變化趨勢，處理A相較于處理B遲一些達到最大值，且POD活性是ck的1.46倍，SA誘導15 d后的植株POD活性仍顯著高于未誘導的植株。

3 討論

誘抗劑有著更好的抗病性和低毒性[15-16]。目前，誘導劑在農業等方面應用廣泛，在林業方面研究相對較少。將誘導劑應用于林業實踐可減少化學殺菌劑的使用，與殺菌劑、生物防治等相結合可達到更好的效果[17-19]。當SA質量濃度低于500 mg·L-1時對孢子萌發無影響，可以證明低質量濃度外源SA的施用對病原菌孢子無直接毒力。本研究證實：不同質量濃度SA對紫楠均具有誘導抗性作用。100 mg·L-1為SA最適宜質量濃度，酶活性均達到最大值，差異顯著。SA處理后可溶性蛋白質質量濃度，SOD、CAT、POD活性先上升然后下降至穩定水平，實驗持續了15 d，所測結果仍高于正常水平，其中CAT變化最為明顯，經SA誘導的紫楠接種或不接種處理，生理指標活性均顯著高于對照，這與山茶[11]、橡膠樹Hevea brasiliensis[20]等抗性誘導研究結果一致。

SA是存在于植物體內的內源性生長物質，可以引起植物體內H2O2濃度升高，促進H2O2生成的化合物，誘導SAR相關蛋白及防御酶等活性的增加，促進相關基因的表達[21-22]。外源SA可以誘發植物觸發病理相關蛋白基因的表達，在誘導植物產生抗病性的同時大量積累病程相關蛋白。外源SA的應用可誘導植物內源性CAT和POD活性增加，以及相關基因的表達，能引發植物的誘導抗性[23]。POD除了具有解毒作用外，還是植物體內多種次生代謝產物生物合成的關鍵調控酶之一，植物次生代謝產物參與了植物對病原體的防御反應，SOD在清除高毒性和不穩定活性氧中起重要作用，CAT、POD和SOD被認為是保護細胞免受氧化損傷的主要抗氧化系統，多種酶活性的升高可能是使植物體產生抗性，抵抗病原菌侵染的重要原因。因此，SA可以誘導楠木對病原菌的入侵產生抗性，為防治提供依據。