外源草酸對綠竹筍抗氧化酶和木質化的影響

俞 暾，鄭 劍，余學軍

（1.浙江農林大學 省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室，浙江 杭州 311300；2.浙江農林大學 林業與生物技術學院，浙江 杭州 311300；3.浙江農林大學 農業與食品科學學院，浙江 杭州 311300）

綠竹Bambusa oldhami是禾本科Gramineae竹亞科Bambusoideae綠竹屬Bambusa的優質筍用竹植物，分布于華南叢生竹林亞區和華中亞熱帶混生竹林亞區南部，5-10月為產筍期[1-3]。綠竹筍形似馬蹄，俗稱“馬蹄筍”，筍肉細嫩，味道鮮美，深受人們喜愛。由于出筍時期溫度較高，加之出筍集中，綠竹筍采后容易發生變質、腐敗、木質化，儲藏難度較大，限制了產品的流通和銷售[4-5]。草酸廣泛存在于動植物和真菌體內，具有很強的抗氧化性[6]。適當濃度的草酸溶液可以作為抗氧化劑應用于果蔬的保鮮、儲藏與運輸等。有研究發現：草酸處理能夠有效延緩鮮切香蕉Musa nana[7]、荔枝Litchi chinensis[8]、去皮荸薺Heleocharis dulcis[9]的變質腐敗，延長保鮮期。關于外源草酸處理對于采后去殼綠竹筍的抗氧化和木質化的影響尚未被報道。因此，本研究以綠竹筍為對象，研究外源草酸對去殼綠竹筍抗氧化酶和木質化的影響，為竹筍的采后儲藏保鮮提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料的選擇與處理

供試材料綠竹筍于2017年7月下旬采自浙江省瑞安市，瑞安市地理坐標27°40′～28°00′N，120°10′～120°15′E，全年無嚴寒酷暑，冬短夏長，四季分明，雨水充沛。全年平均氣溫17.9 ℃，年平均降水量1 110～2 200 mm，歷史年平均降水量1 527.2 mm。挑選外觀完好且直徑和長度相近的綠竹筍，放置于泡沫箱中6 h內運至實驗室。綠竹筍樣品切除基部2～3 cm不可食用部分，小心剝除筍殼，用自來水清洗干凈瀝干，處理組浸入5 mmol·L-1草酸溶液中10 min(該草酸濃度和處理時間為前期預實驗獲得的最佳處理參數)，對照組浸入自來水保持同等時間，取出瀝干后于陰涼通風處晾干，然后放于塑料筐中，套0.5 mm厚度的聚乙烯袋，不封口，置于(6±1) ℃的恒溫恒濕箱(Sanyo，MIR-554)中儲藏。處理當天取樣為T0，隨后每天隨機取樣，取樣時間為Tn，n=1、2、3、4、5、6 d，取筍體基部切口位置往上2～4 cm的一段筍肉用于指標測定。每個處理每次取5根筍樣，重復3次。

1.2 測定項目及測定方法

過氧化氫(H2O2)質量摩爾濃度采用蘇州科銘生物技術有限公司過氧化氫試劑盒測定。超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化氫酶(CAT)活性、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性、過氧化物酶(POD)活性參照曹建康等[10]的方法。木質素質量分數參照鞠志國等[11]的方法。4-香豆酸-輔酶A連接酶(4-CL)活性參照畢詠梅等[12]的方法并加以修改。羥基肉桂醇脫氫酶(CAD)活性參照CAI等[13]的方法并加以修改。基因表達量采用大連TaKaRa公司SYBR Premix Ex TapTM(TliRNaseH Plus)Kit測定。

1.3 統計與分析方法

用Excel進行數據統計分析及圖表制作；用SPSS 22進行0.05水平差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 低溫下草酸對采后綠竹筍過氧化氫質量摩爾濃度和抗氧化酶活性的影響

由圖1A可知：草酸處理組與對照組的綠竹筍H2O2質量摩爾濃度在冷藏期間的變化趨勢基本一致，總體上呈先上升后下降的趨勢，草酸處理組的H2O2質量摩爾濃度在冷藏2～6 d時顯著低于對照組(P＜0.05)，比對照組分別降低了9.2%、8.5%、14.3%、10.2%和12.2%。由圖1B和C可知：草酸處理組與對照組的綠竹筍SOD和CAT活性在冷藏期間的變化趨勢基本一致，總體上呈先上升后下降的趨勢；草酸處理組的SOD活性在冷藏2～6 d時顯著高于對照組的SOD活性(P＜0.05)，比對照組分別提高了23.4%、41.5%、18.1%、14.6%和16.4%；草酸處理組的CAT活性在冷藏2～6 d時顯著高于對照組(P＜0.05)，比對照組分別提高了20.2%、7.1%、78.4%、29.7%和25.6%。由此表明：外源草酸處理可以提高綠竹筍體內抗氧化酶SOD、CAT的活性，并延緩H2O2的積累。

2.2 低溫下草酸對采后綠竹筍木質素質量分數與硬度的影響

如圖2可知：草酸處理組與對照組的綠竹筍木質素質量分數和硬度在冷藏期間的變化趨勢基本一致，總體上呈上升趨勢。由圖2A可知：草酸處理組的木質素質量分數在冷藏的2、3和5 d時顯著低于對照組(P＜0.05)，比對照組分別降低了25.3%、17.3%、12.7%。由圖2B可知：草酸處理組的硬度在冷藏的3～5 d時顯著低于對照組(P＜0.05)，比對照組分別降低了30.5%、33.8%、16.5%。由此說明：外源草酸處理可以延緩綠竹筍木質素的積累和硬度的上升。

2.3 低溫下草酸對采后綠竹筍木質素合成關鍵酶活性的影響

如圖3可知：草酸處理組與對照組的綠竹筍PAL、4-CL、CAD、POD活性在冷藏期間的變化趨勢基本一致。如圖3A可知：PAL活性總體上呈上升的趨勢，草酸處理組的PAL活性在冷藏2～5 d時顯著低于對照組(P＜0.05)，比對照組分別降低了23.3%、25.8%、16.0%、18.2%。如圖3B可知：4-CL活性總體上呈先上升后下降的趨勢，草酸處理組的4-CL活性在冷藏3 d時顯著低于對照組(P＜0.05)，比對照組降低了26.3%。如圖3C可知：CAD活性總體上呈先上升后下降的趨勢，草酸處理組的CAD活性在冷藏3～5 d時顯著低于對照組(P＜0.05)，比對照組分別降低了17.7%、17.0%、19.7%。如圖3D可知：POD活性總體上呈先上升后下降的趨勢，草酸處理組的POD活性在冷藏2～3 d時顯著低于對照組(P＜0.05)，比對照組分別降低了19.9%、21.1%。由此表明：外源草酸處理可以抑制綠竹筍木質素合成關鍵酶PAL、4-CL、CAD、POD活性的上升。

2.4 低溫下草酸對采后綠竹筍木質素合成關鍵酶基因表達量影響

如圖4可知：草酸處理組與對照組的綠竹筍PAL、4-CL、CAD、POD基因相對表達量在冷藏期間的變化趨勢基本一致。由圖4A可知：PAL基因相對表達量總體上呈先下降后上升再下降的趨勢，草酸處理組的PAL基因相對表達量在冷藏3～5 d時顯著低于對照組(P＜0.05)，比對照組分別降低了37.4%、28.1%、45.4%。由圖4B可知：4-CL基因相對表達量總體上呈上升的趨勢，草酸處理組的4-CL基因相對表達量在冷藏3～5 d時顯著低于對照組(P＜0.05)，比對照組分別降低了45.0%、17.5%、28.1%。由圖4C可知：CAD基因相對表達量總體上呈先上升后下降的趨勢，草酸處理組的CAD基因相對表達量在冷藏2～3 d時顯著低于對照組(P＜0.05)，比對照組分別降低了34.7%、48.2%。由圖4D可知：POD基因相對表達量總體上呈下降的趨勢，草酸處理組的POD基因相對表達量略低于對照組，差異不顯著(P＞0.05)。由此說明：外源草酸處理可以抑制PAL、4-CL、CAD和POD基因的表達。

圖3 低溫下草酸對綠竹筍PAL、4-CL、CAD和POD活性的影響Figure 3 Effects of oxalic acid treatment on PAL, 4-CL, CAD and POD activities of bamboo shoots at low temperature

圖4 低溫下草酸對綠竹筍PAL、4-CL、CAD和POD基因相對表達量的影響Figure 4 Effects of oxalic acid treatment on PAL, 4-CL, CAD and POD relative expression of bamboo shoots at low temperature

3 討論與結論

本研究表明：外源草酸處理可以提高綠竹筍體內抗氧化酶SOD、CAT的活性并延緩H2O2質量摩爾濃度的積累；可以延緩木質素的積累和硬度的上升；既可以抑制綠竹筍木質素合成關鍵酶PAL、4-CL、CAD、POD活性的上升，又可以抑制PAL、4-CL、CAD和POD基因的表達；可以減緩綠竹筍的木質化進程，延緩綠竹筍品質的下降，延長綠竹筍的保鮮期。

植物在受到外界逆境脅迫時會產生活性氧(ROS)，導致細胞膜脂過氧化，破壞生物膜的結構和功能，嚴重則會致使細胞程序性死亡。為了抵御ROS的傷害，植物體會激活體內抗氧化防御系統，提高抗氧化酶的活性，以消除ROS[14-17]。本研究結果顯示：在低溫儲藏下，草酸處理組的去殼綠竹筍筍肉組織中的H2O2質量摩爾濃度顯著低于對照組(P＜0.05)，較低的H2O2質量摩爾濃度有助于減輕ROS對筍肉細胞的毒害。草酸處理組的去殼綠竹筍筍肉組織中的SOD和CAT活性顯著高于對照組(P＜0.05)。梁春強等[18]研究認為：適合濃度的草酸處理不但可以顯著提高氧化酶SOD和CAT的活性，還可以有效降低O2-的生成速率和H2O2的含量。

木質素為植物次生代謝的產物，屬酚類化合物，是構成細胞壁次生結構的主要成分。竹筍在采后非常容易老化變質，失去食用價值，其中一個重要的因素就是木質化。木質化主要表現為筍體組織硬度上升，木質素質量分數增加，筍體發生褐變等[19-21]。除了竹筍，茭白Zizania latifolia、蘆筍Asparagus officinalis等蔬菜在采后儲藏過程中均有木質化的發生[22-25]。本研究發現：低溫條件下儲藏，草酸處理不但可以抑制綠竹筍硬度的上升，還能夠減緩木質素的生物合成，抑制采后去殼竹筍的木質化，維持較好的口感品質，延長竹筍可食用期限。與王琪等[26]研究的采用外源草酸抑制帶殼雷竹Phyllostachys praecox筍木質素的合成累積以及硬度的上升的結論相似。

PAL、4-CL、CAD和POD等4種酶與木質素的合成有密切的關系，其活性的升高都能促進木質素的合成，提高組織的木質化程度。本研究結果表明：低溫條件下，經草酸處理的綠竹筍的PAL、4-CL、CAD和POD的活性均低于對照組，草酸處理在總體上明顯抑制了去殼綠竹筍的木質素生物合成關鍵酶的活性。這與沈玫等[27]研究的利用外源草酸抑制帶殼綠竹筍PAL和POD活性的結論類似。

果蔬的木質化進程受編碼木質素代謝的關鍵酶基因的表達調控。LU等[28]研究發現：PpCAD1和PpCAD2這2個基因主要調控梨Pyrus pyrifolia的木質素代謝生物合成。不同種類的果蔬，調控木質素合成關鍵酶的基因也不同，SHAN等[29]研究表明，調控枇杷Eriobotrya japonica的木質素代謝基因主要是EjCAD1、EjPOD、EjPAL2這3個基因。此外，大多數研究人員認為是PAL、4-CL、CAD和POD的活性與其對應基因的表達在協同調控木質素的合成[30-31]。本研究結果表明：草酸處理在冷藏的中后期能夠顯著抑制去殼綠竹筍的木質素合成關鍵酶PAL、CAD和4-CL的基因表達水平，可以抑制POD的基因表達水平。結合硬度、木質素質量分數以及對應酶的活性的變化趨勢分析可見，PAL、4-CL、CAD基因表達與硬度、木質素質量分數以及酶活性的變化趨勢相一致，POD基因表達與硬度、木質素質量分數以及酶活性的變化趨勢相反，說明綠竹筍木質素合成關鍵酶的基因表達和活性變化同步調控木質素的生物合成。LU等[28]研究發現：利用氯化鈣可以抑制梨果肉中PpCAD1和PpCAD2基因表達，從而調控木質素的生物合成途徑，最終達到抑制梨的硬化的效果，這與本研究結果類似。另外，SEWALT等[32]研究發現，煙草Nicotiana tabacum的PAL基因在受到抑制之后，不但木質素質量分數明顯下降，PAL的活性也明顯降低。本研究中草酸處理既抑制了木質素代謝關鍵酶活性，又抑制了對應基因表達水平，從2個方面抑制了去殼綠竹筍筍肉硬度的上升和木質素的累積，延緩了冷藏過程中竹筍食用品質的下降。