夏季遮光對連香樹幼苗形態、光合作用及葉肉細胞超微結構的影響

李冬林，金雅琴，崔夢凡，黃琳曦，裴文慧

（1.江蘇省林業科學研究院，江蘇 南京 211153；2.金陵科技學院 園藝學院，江蘇 南京 210038）

光是植物進行光合作用的重要因素之一，對植物的生長發育及形態建成具有重要影響[1]。長期庇蔭必然影響陽性植物的生長發育，但適度遮光則有利于陰性植物的更新繁育和進展演替。在不同的光環境下，植物往往會在形態結構、生長發育、光合作用、生理生化和形態解剖等方面發生相應的可塑性改變，以維持其正常的生命活動[2]。葉片可塑性的大小是衡量植物對異質環境適應能力的重要指標，葉片可塑性常與植物對環境具有高的潛在適應能力緊密聯系[3]。因此，研究遮光條件下植物生理特點和解剖結構的變化，可以反映某種特定植物對光照強度的反應，進而推斷其對庇蔭環境的忍耐性，這對于指導農林業生產，提高種苗繁育的成活率和保存率，改進生產管理措施具有重要意義。連香樹Cercidiphyllum japonicum是連香樹科Cercidiphyllaceae連香樹屬Cercidiphyllum植物，中國特有第三紀孑遺單科屬植物。該種雌雄異株，結實較少，天然更新困難，資源稀少，已瀕臨滅絕狀態，因此被列入國家Ⅱ級重點保護野生植物種[4-5]。在中國，連香樹分布于山西西南部、河南、陜西、甘肅、安徽、浙江、江西、湖北及四川等地[6]，但多零星分布，成片資源很少。近年來，由于大規模旅游開發和人為干擾的影響，中國連香樹資源趨于萎縮，亟待采取人為措施予以保護。目前，連香樹自然結實率低，天然更新困難，林下幼樹極少，種群的挽救和保護依然存在一定困難。有關連香樹的生物學特性已有一定文獻報道，但多集中在形態解剖[7]、種群結構[8]、種子萌發[9]及群落遺傳[10]等方面。與種群更新和保育緊密相關的需光性及耐蔭性研究較少。本研究以2年生實生苗為研究對象，通過人為遮光創造不同梯度的光環境，分析夏季遮光條件下連香樹幼苗生理生態參數和葉片超微結構的變化，旨在為連香樹種苗培育和野生種群的更新保護提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗地自然條件

試驗地位于江蘇省林業科學研究院實驗林場(南京市江寧區東善橋，31°51′25′′N，118°46′37′′E)。地處北亞熱帶的邊緣，季風氣候，年均氣溫16.1 ℃，極端最高氣溫43.0 ℃，極端最低氣溫-14.0 ℃，年相對濕度78%～80%，年降水量1 116.3 mm，年均日照時數1 912.8 h，無霜期224.0 d。試驗土壤為山地黃棕壤，pH為6.8。

1.2 試驗設計

供試材料來自湖北省宜昌市五峰縣，為生長健壯、規格一致的2年生實生苗。于2018年3月下旬定植，經過3個月的緩苗生長后，當年6月20日開始用黑色遮陽網進行遮光處理，并一直維持到10月下旬。遮光棚南北設置，棚高2.0 m，兩邊覆蓋苗床并延伸到地面，南北敞開，便于通風透氣。試驗設4個處理：1層遮光(L1，輻射光強相當于全光照55%)、2層遮光(L2，輻射光強相當于全光照25%)、3層遮光(L3，輻射光強相當于全光照10%)，全光照(L0，輻射光強100%)為對照處理。采用單因素隨機區組設計，重復3次(即3個區組)，不同區組間平行排列，區組內隨機設置遮光小區，每小區處理幼苗30株，并掛牌標記。為避免交錯影響，不同處理間留有1.5 m的間距。苗木生長期間正常土壤管理，確保苗田無雜草、地面不干旱，不同處理間栽培技術措施一致。

1.3 指標測定與方法

1.3.1 光合作用參數 8月選取連續晴朗的白天，利用LI-6400型便攜式光合作用測定儀進行光合作用日變化測定。不同處理選擇發育完好的幼苗各3株，每株選擇3片位置相當、發育成熟的功能葉(頂端數第4片，葉柄涂標)測定，連續測定3 d。自7:00-18:00，隔2 h測定1次，每次測定40～60 s。測定均采用自然光源，標準葉室(2 cm×3 cm)。測定光合指標有：凈光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)、蒸騰速率(Tr)、胞間二氧化碳(CO2)摩爾分數(Ci), 利用公式Pn/Tr計算葉片的水分利用效率(EWUE)。同時記錄不同處理的環境參數：光合有效輻射(PAR)、氣溫(Ta)、大氣相對濕度(HR)、CO2摩爾分數(Ca)等。

1.3.2 光合色素及生長指標 自7月10日開始，選取標記葉片同等位置的功能葉測定光合色素。隔20 d取樣1次，取樣持續到9月底。葉綠素采用質量分數為80%丙酮提取，分光光度法，并根據Arnon公式計算[11-12]?；鶑?D)和苗高(H)采用卷尺和游標卡尺測量，利用生物量模型D2H比較不同處理下幼苗的生物量差異[13]。

1.3.3 葉片含水量與葉片形態 9月末剪取標記的功能葉測定葉片含水量與葉片形態。葉面積采用AM-300手持式葉面積儀測定；葉片含水量(CLWC)采用烘干法測定，并用以下公式計算：CLWC=(葉鮮質量-葉干質量)/葉干質量×100%；比葉面積(SLAM)和比葉重(mLMA)由以下公式換算：SLAM=(葉面積/葉干質量)；mLMA=(葉干質量/葉面積)×100%[14]。

1.3.4 葉片超微結構 10月上旬測定葉片超微結構。不同處理采集涂標的功能葉(頂端數第4片)，中部近葉脈處取材，取材大小為1.5 mm×1.5 mm。放入預冷的質量分數為2.5%戊二醛中固定12 h (4 ℃)，0.1 mol·L-1磷酸緩沖液(pH 7.2)漂洗3次，每次20 min。然后轉移至質量分數1%的鋨酸中后固定4 h(4 ℃)，丙酮梯度脫水，之后用SPI-812樹脂滲透、包埋，Leica UC6超薄切片機切成 60～80 nm超薄切片，醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染色，用日立H-7650型透射電鏡觀察，并用Gatan公司生產的832SC1000W數字成像系統拍照。

1.4 數據處理

所有數據采用平均值±標準差的形式表示，應用Excel 2003作圖，SPSS 17.0進行方差分析和相關分析，多重比較采用最小顯著極差法(LSD法)。

2 結果與分析

2.1 遮光對連香樹單葉面積(SLA)、單葉干質量(mSLWd)、單葉鮮質量(mSLWf)及葉片含水量(CLWC)的影響

從表1和圖1可見：遮光對連香樹幼苗的葉片發育有顯著影響。遮光與全光照相比，其SLA有顯著差異(P＜0.05)，表現為遮光后個體SLA顯著增大，尤以L3處理的SLA最大(34.88 cm2)，為全光下SLA的2.024倍，L1和L2處理的SLA與全光下相比也有顯著差異(P＜0.05)。全光下單葉鮮質量(mSLWf)與L1、L2差異不顯著(P＞0.05)。單葉干質量(mSLWd)也呈現類似的變化。從葉片含水量(CLWC)的變化來看，隨著遮光強度的增強，葉片CLWC顯著增加(P＜0.05)，這可能與遮光后林內氣溫下降、相對濕度適量增加有關。

表1 不同遮光條件下連香樹葉片含水量及葉片形態指標的變化Table 1 Changes of leaf water content and morphology indexes of C.japonicum leaves under different shading treatments

圖1 遮光對連香樹葉片形態發育的影響Figure 1 Effect of shading on morphological development of C.japonicum leaves

2.2 遮光對連香樹葉片比葉面積(SLAM)和比葉重(mLMA)的影響

比葉重(mLMA)為單位面積葉干質量，反映了葉片干物質積累的多少[14]。從表1可見：遮光對mLMA和SLAM的影響較大，表現為隨著遮光強度的增強mLMA日趨減小，而SLAM則日漸增大，呈現出顯著差異(P＜0.05)。遮光引起幼苗SLA和mSLWd的改變，進而導致了mLMA和SLAM的顯著變化。

2.3 遮光對連香樹葉片光合作用日變化的影響

2.3.1 凈光合速率(Pn) 全光和遮光處理下Pn呈現出不同的變化特征(圖2A)。比較而言，全光下Pn變化呈現不對稱的“幾”字形，12:00之前處于高位變化，而且最大值出現在14:00，14:00后急劇下降；L1處理下Pn的變化與L0類似，但其變化較為緩和，峰值出現在12:00；L2和L3處理下Pn則呈現近對稱的“幾”形變化。由于遮光的影響，林內光合輻射下降，12:00時Pn最大值僅為全光下0.61和0.42倍。日均Pn從大到小排序為L0、L1、L2、L3。方差分析表明：不同處理下日均Pn有顯著差異(P＜0.05)。

2.3.2 氣孔導度(Gs) 一般而言，氣孔導度反映大氣二氧化碳和水汽與植物葉片傳導、交換能力的高低。由圖2B可見：遮光處理下Gs呈現先升高后降低的變化特征，但與對照相比起伏較小。遮光處理下，11:00時之前葉片中Gs基本是緩慢升高的，12:00呈現最大值，午后開始下降，這一點與Pn的變化基本相似，表明其變化與Pn呈一定相關性。從全光下Gs的日變化進程來看，10:00之前略有下降，但10:00之后就迅速升高，14:00達最大值，在所有時間段內Gs一直高于其他遮光處理。日均Gs從大到小排序也為L0、L1、L2、L3。方差分析表明：不同處理間日均Gs有顯著差異(P＜0.05)，但L1與L2間差異不顯著。

圖2 不同遮光條件下連香樹葉片凈光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)、胞間二氧化碳摩爾分數(Ci)、蒸騰速率(Tr)的日變化Figure 2 Diurnal variation of net photosynthesisrate (Pn), stomatal conductance (Gs), intercellular CO2 concentration (Ci) and transpiration rate (Tr)of C.japonicum leaves under different shading treatments

2.3.3 胞間二氧化碳摩爾分數(Ci) 不同遮光下Ci呈基本一致的凹形變化，即中午之前緩慢降低，但午后逐漸抬升(圖2C)。不同處理下日均Ci從大到小依次為L3、L2、L1、L0。方差分析表明：不同處理間Ci差異顯著(P＜0.05)。L3處理強度遮光，14:00以后光照強度已經很低，而且Gs下降，二氧化碳同化率低，致使較多的二氧化碳積聚在細胞間，導致Ci的快速升高。

2.3.4 蒸騰速率(Tr)和水分利用效率(EWUE) 由圖2D可見：全光下，Tr的變化幅度較大，尤以12:00的Tr增加最甚，并顯著高于遮光處理下的測定值(P＜0.05)；而遮光處理下Tr的變化較為緩和，并在14:00出現了下降，表明遮光顯著抑制了幼苗的蒸騰作用。就日均Tr從大到小依次為L0、L1、L2、L3，分別為遮光處理下的3.48(L1)、2.58(L2)、2.51(L3)倍。方差分析表明：L1與L2間差異不顯著，但L0與3種遮光處理間均有顯著差異(P＜0.05)。

依據Pn和Tr可以估算幼苗的EWUE。由于L1處理具有較高的Pn和相對穩定的Tr，在所有處理中EWUE最大(2.82)，顯著高于重度遮光(L2、L3)下的測定值(1.73、1.27)(P＜0.05)。

2.4 凈光合速率與葉片含水量及葉片形態指標的相關關系

將不同遮光處理下連香樹幼苗凈光合速率與光合有效輻射(PAR)、葉片含水量(CLWC)及葉片形態指標作相關分析見表2。結果表明：Pn與PAR、mLMA呈顯著正相關(P＜0.05)，而與CLWC呈極顯著負相關(P＜0.01)，與SLA呈顯著負相關(P＜0.05)；Pn與mSLWf和mSLWd相關性均不顯著。可見，遮光條件下，盡管植株SLA增加，但由于mLMA減小，Pn卻隨之下降，進而影響到幼苗正常的生理生長。

2.5 遮光對連香樹光合色素及幼苗生長的影響

2.5.1 不同遮光條件下連香樹光合色素的變化 葉綠素是植物光合作用的最有效的光能吸收色素，而類胡蘿卜素也是不可缺少的色素，因此葉綠素和類胡蘿卜素質量分數是分析植物光合作用能力的主要參數。反過來，環境中光照條件的變化也影響到葉綠素及類胡蘿卜素的合成與分解，通過增加單位葉面積色素來提高其捕光能力[15-16]。由表3可知：遮光對連香樹葉片葉綠素及類胡蘿卜素質量分數均有顯著影響(P＜0.05)。遮光初期(20 d)不同處理間連香樹葉片內類胡蘿卜素已有顯著差異(P＜0.05)，表現出遮光條件下葉綠素和類胡蘿卜素顯著增加，說明遮光處理促使了葉片內葉綠素的快速積累；隨著遮光時間的延續，不同處理間葉片內葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a+b、類胡蘿卜素差值逐漸變小，但多重比較顯示仍有顯著差異(P＜0.05)。總的趨勢來看，遮光條件下葉片內葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a+b、類胡蘿卜素均有增加，且隨著遮光強度的加大其質量分數遞增。同時，隨著遮光處理的持續葉綠素及類胡蘿卜素質量分數遞減，說明短時間內遮光對色素質量分數的影響較小，隨著遮光時間的延長葉片內光合色素的合成受到抑制，質量分數呈現遞減趨勢，尤其是葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a+b的變化較為明顯。

2.5.2 遮光對連香樹幼苗生長指標的影響 遮光降低了林內光照輻射強度，影響到連香樹幼苗的生長形態。遮光處理后，連香樹幼苗的分枝數目變化不大，但苗高(H)和基徑(D)依次遞減，最終影響到幼苗的生物量(表4)。多重比較表明：L1與對照相比，H、D、H/D、D2H和分枝數目均沒有顯著差異，說明輕度遮光(L1)沒有對幼苗的生長帶來明顯的生長抑制。但是，重度遮光(L2和L3)下，H、D和D2H明顯小于對照(L0)(P＜0.05)，說明遮光對幼苗的生長產生顯著的抑制作用，對幼苗的成長不利。

表2 連香樹葉片光合作用參數與葉片含水量及形態指標的相關性Table 2 Relationship of the photosynthesis parameters with relative water contents and morphology indexes of C.japonicum leaves

表3 不同遮光條件下連香樹葉片葉綠素及類胡蘿卜素質量分數的變化Table 3 Changes of chlorophyll and carotenoid content of C.japonicum leaves under different shading treatments

表4 遮光對連香樹幼苗生長指標的影響Table 4 Effects of shading on growth indexes of C.japonicum seedlings

2.6 遮光對連香樹葉片葉肉細胞超微結構的影響

葉綠體是植物進行光合作用的場所，也是細胞中對逆境最敏感的細胞器[17]。因此，分析葉片中葉綠體的結構變化可以為植物遭受不良生境下的生理反應作出解釋。從葉片超微結構(圖3)可以看出：全光(L0)條件下，高強度光輻射葉肉組織中細胞輪廓可鑒，葉綠體(Ch)數量少，緊靠細胞壁(CW)邊緣成平行分布，形狀如梭形，中央淀粉粒(S)明顯。由于葉綠體邊緣分布，細胞中央形成有大的空腔，類囊體片層與葉綠體長軸近似平行排列，基粒類囊體(Th)略有膨脹，基質片層有模糊，未見有嗜鋨顆粒(OG)分布(圖3A、E)；L1處理下細胞內輪廓清晰，Ch數量有所增加，在細胞中占有面積增加，但與CW之間的間隙加大，OG相應數量明顯增加，S數量減少，葉綠體中Th排列緊密，之間通過基粒片層相連(圖3B、F)；L2、L3處理細胞結構與葉綠體變化不大，但葉綠體數量顯著增多，細胞內空腔面積減小，葉綠體外形逐漸變為圓球形或橢圓形，S數量較多，在細胞中占有比例較大，零散分布有OG，Th結構尚清晰，片層厚度加大，但排列位置不規則，出現了部分黑色斑塊(圖3C、G、D、H)，這可能與過度遮光的陰濕環境有關。

圖3 不同光環境下連香樹葉片葉肉細胞超微結構Figure 3 Ultrastructure of mesophyllic cells of C.japonicum leaves under different shading treatments

3 結論與討論

光是影響植物生長發育最主要、最直接的外界因素之一[17-18]。因此，光照條件的改變直接影響植物個體的外部形態及生長發育。不同強度的遮光處理對連香樹幼苗的形態產生了顯著影響，表現為隨著遮光強度的增大，CLWC、SLA顯著增加，mLMA明顯減小，但SLAM增大，這與文獻[19]的研究結果基本類似。全光下，幼苗適應高強度的光輻射，葉片具有較高的mLMA，較低的SLAM，單葉面積較小，說明葉片充分發育，葉片較厚，從而減緩了光在葉片內部的傳導。這樣可以避免強光對葉片內部機構造成破壞，是一種生理適應；而弱光下葉片蒸騰較弱，CLWC較高，具有較低的mLMA和較高的SLAM，單葉變得薄而具有較大的SLA，說明幼苗通過擴大葉面積而獲取更多的光強，以彌補庇光環境下的光照不足。

遮光對連香樹幼苗的光合作用產生了顯著影響。全光和L1處理下Pn的變化曲線相似，在1 d中呈現不對稱的“單峰”，L2和L3處理下Pn則呈現近“幾”形變化，Tr、Gs也出現與Pn類似的特征。據研究，植物光合作用日變化有單峰[20]、雙峰、三峰[21]等類型，這與不同植物自身生物學特性和試驗測定時幼苗所處的環境條件有關[22]。全光和L1處理下，早晨太陽有效輻射升高很快，造成幼苗Pn快速上升，這是Pn呈現不對稱“單峰”變化的重要原因。全光下，白天外界有效輻射長時間在2 000 μmol·m-2·s-1以上，但過剩的強光并未有對連香樹幼苗的組織器官造成明顯灼傷，未出現明顯的“午休”和光抑制，而L1下，幼苗生長生理的小環境得到一定改善，Tr變弱，盡管光照輻射強度減弱，幼苗仍能夠維持較高的Pn和相對較高的EWUE。從這一點來看，連香樹對外界強光具有一定的忍耐性，輕度遮光也未對幼苗的生長帶來明顯的抑制性影響。

葉綠素質量分數及相對比例同光合作用的關系十分密切，在一定程度上可以反映植物同化物質的能力[23]。本研究表明：遮光條件下連香樹葉片葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a+b、類胡蘿卜素均有一定程度增加，而且隨著遮光強度的加大其質量分數遞增。李霞等[23]認為：耐蔭性植物品種遮光后植株葉片葉綠素質量分數增加，而不耐蔭的植物品種葉綠素質量分數降低。從這一理論可以推斷，連香樹又表現出一定的耐蔭性[24]。同時，遮光時間的長短也影響葉片內光合色素的變化，短期內連香樹葉片內光合色素已存在顯著增加，說明連香樹對短期庇蔭具有敏感性。長期庇蔭的光環境將引起連香樹葉片光合色素的適應性增加，增強了葉片的捕光性，這對于幼苗的營養積累和健壯生長是有利的，說明連香樹對外界庇蔭的環境具有一定的適應能力。

大量研究表明：遮光不僅會造成植物光合生產能力的降低，而且會對光合器官的微觀結構產生影響[25]。長期生活在弱光條件下，植物葉綠體根據光線的強弱將做出形態上的調整，甚至發生結構的變化，以增強對弱光的吸收利用能力[26-27]。因此，分析葉肉細胞超微結構可以為遮光處理對幼苗的生理功能的影響機制找到解釋。本研究表明：遮光對連香樹葉肉細胞超微結構帶來一定影響，進而影響到幼苗光合產物的積累。全光下連香樹葉綠體緊靠細胞壁平行分布，形狀如梭形，細胞中央形成有大的空腔，但葉綠體數量偏少。而遮光條件下，特別是強度遮光，細胞內空腔面積減小，葉綠體數量明顯增加，葉綠體外形逐漸變為圓球形或橢圓形，淀粉粒數量增多，這將有利于葉綠素片層附著更多的補光色素與光合酶，有利于植物吸收較多的光能以彌補弱光的不足，提高其光合作用效率，這與HIKOSAKA等[28]和LIN等[29]的研究結論基本一致。遮光條件下，葉綠體中淀粉粒數量增多，這可能是由于光合產物合成后迅速轉化為淀粉暫時儲存于葉綠體中，而弱光下同化產物的運輸速度相應降低，使得淀粉積累在葉綠體內形成較大的顆粒。同時，遮光條件下葉綠體類囊體葉綠體膜發育不完全，嗜鋨顆粒增多，類囊體結構尚清晰，但排列位置不規則，出現了部分黑色斑塊，這可能與過度庇蔭的陰濕環境有關。

由于遮光降低了林內光合輻射強度，影響了幼苗的光合作用效率，改善了林內小環境，最終會影響連香樹幼苗的生長形態。本研究表明：強度遮光條件下，連香樹H和D遞減，生物量模型D2H明顯下降，說明強度遮光會影響幼苗正常的生長發育，不利于幼苗的健康。同時，輕度遮光與對照相比，H、D、H/D和D2H均未出現顯著差異?？梢?，連香樹對光照條件的改變具有一定的自我調節能力。輕度遮光下，幼苗仍能維持較高的Pn，以確保植株生長良好；而中度和重度遮光則會嚴重降低連香樹的Pn，并導致植株營養缺乏，生長受抑，影響植物個體的質量。因此，在育苗實踐中，夏季可以對其進行適度的遮光處理，以降低高溫和日灼危害，并可以減少土壤水分蒸發，緩和高溫干旱對幼苗生長的制約，但遮光強度不能過大，有效輻射光強以不低于自然光強的55%為宜，以滿足幼苗正常生長發育所需要的環境條件。