大豆種莢應答鐮刀菌侵染的葉綠素熒光成像規律

龍希洋，肖新力,2，張啟輝，楊文鈺，劉 江,2，張 靜,3

（1.四川農業大學 農業部西南作物生理生態與耕作重點實驗室，四川 成都 611130；2.四川農業大學 生態農業研究所，四川 成都 611130；3.四川農業大學 園藝學院，四川 成都 611130）

大豆Glycine max富含蛋白質、多糖、不飽和脂肪酸、異黃酮，具有豐富的營養價值[1]。中國西南地區“寡日、高濕、小溫差”的特殊生態環境，致使大豆抗逆性差、極易發生田間霉變、品質劣變嚴重，危害食品安全，這成為阻礙南方大豆發展的重要瓶頸[2]；選育田間霉變抗性品種是突破該瓶頸問題的有效途徑之一。前期研究表明：輪枝鐮刀菌Fusarium verticillioides為大豆田間霉變的主要致病菌[3]，不同大豆種質資源的種莢對輪枝鐮刀菌的感病性存在顯著差異[4]。禾谷鐮刀菌F.graminearum會抑制小麥Triticum sestivum光合作用相關基因導致其光合作用下降[5]；尖孢鐮刀菌F.oxysporum會破壞枸杞Lyciumsp.葉片的光合機構，使得感病品種的葉綠體色素降解，凈光合速率、蒸騰速率以及葉綠素熒光參數急劇下降[6]。葉綠素熒光動力學技術在測定植物光合過程中光系統對光能的吸收、分配等方面具有獨特作用，能直觀顯示植物受脅迫時的變化過程，可檢測由病毒、細菌、真菌感染引起的生理變化；其在黃瓜Cucumis sativus[7]、小麥[8]、水稻Oryza sativa[9]等多種植物上得到了較快的普及和廣泛應用[10]。本研究以豆莢抗性不同的3個典型大豆種質為試驗材料，監測輪枝鐮刀菌接種在豆莢后葉綠素熒光參數變化情況，旨在尋找評價大豆種莢田間霉變抗性的指標，為抗性大豆新品種的選育奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理

試驗于2018年在四川農業大學教學科研園區(四川雅安)進行。供試材料為3種不同抗性大豆種質，包括高抗大豆‘QWT15-2’、中抗大豆‘E1’和易感大豆‘E314’。供試的輪枝鐮刀菌由農業部西南作物生理生態與耕作學重點實驗室提供。

大豆于6月15日播種，生長至鼓粒期(R6)時取樣；采集長勢一致的健康、飽滿豆莢，用冰盒帶回實驗室，以無菌水沖洗干凈備用。每個種莢用無菌注射器破損3處表皮，向損傷部位接種5 μL菌懸液(106cuf·mL-1)，對照組用等量的無菌水處理。隨后，將豆莢置于鋪有濕潤濾紙的無菌培養皿中，10皿·品種-1，接種種莢3～6個·皿-1。于接種后1、2、3、4、5 d監測種莢的葉綠素熒光參數。

1.2 葉綠素熒光成像分析

種莢經暗適應20 min后，采用CF Imager葉綠素熒光成像系統(英國Technologica公司)測定其初始熒光(Fo)、最大熒光(Fm)、可變熒光(Fv)、PSⅡ最大光化學量子產量(Fv/Fm)、非光化學猝滅系數(QNP，qN)、PSⅡ實際光化學量子產量(ΦPSⅡ)、光電子傳遞速率(RET)等葉綠素熒光參數，并對熒光參數進行成像分析。采用Microsoft Excel 2010軟件整理數據、作圖，SPSS 23.0軟件統計分析。

2 結果與分析

2.1 種莢接種輪枝鐮刀菌后的熒光成像及參數分析

對不同抗性大豆種莢接種霉菌1～5 d內的葉綠素熒光參數進行時序性監測。由圖1A～B可知：高抗大豆‘QWT15-2’在接菌培養的5 d內，未發現明顯的病斑產生；中抗大豆‘E1’和感病大豆‘E314’則在接菌1 d后即出現了小塊病斑，并隨著接種培養時間的延長，病斑處顏色和區域增加越加明顯，熒光強度顯著降低。Fv/Fm和QNP的成像變化與豆莢的受害呈現出明顯的相關性。在圖1C～D中，高抗大豆‘QWT15-2’在接種5 d后，與對照相比，Fv/Fm具有明顯的應答響應，熒光強度雖成顯著降低，但仍可以達到0.73，而中抗和敏感的‘E1’和‘E314’病斑處，Fv/Fm圖像分別在接種后4和1 d呈現深藍色，且Fv/Fm熒光強度明顯降低，與受侵染處組織受到破壞的程度表現出一致性，QNP的熒光成像和參數與之呈現出類似的變化特征?？傮w表現為種莢霉變病級越高，病斑處區域則越大，Fv/Fm和QNP越低，變化幅度越大；高抗種莢的Fv/Fm和QNP高于中抗和敏感品種，但變化幅度小于中抗和敏感品種。

圖1 接種輪枝鐮刀菌后的種莢Fv/Fm和QNP成像及參數變化Figure 1 Fv/Fm and QNP imaging and parameter changes of soybean pods after inoculation with F.verticillioides

2.2 接種過程中的種莢初始熒光參數變化

大豆種莢接種輪枝鐮刀菌后，其初始葉綠素熒光參數發生變化，不同抗性豆莢的變化存在差異(圖2)。與對照相比，在接菌培養的5 d內，易感大豆‘E314’的初始熒光參數變化最為劇烈，Fo、Fm及Fv均呈降低趨勢，且在培養的5 d內，各參數的平均降低幅度分別為32%、58%、66%；中抗大豆‘E1’的初始熒光參數變化較為緩和，Fo、Fm及Fv也主要呈降低趨勢，其各參數的平均降低幅度分別為6%、19%、22%；而高抗大豆‘QWT15-2’的3個初始熒光參數變化幅度僅為7%、8%、13%。這表明種莢受輪枝鐮刀菌侵染后，高抗材料初始熒光變化幅度最小，中抗材料其次，敏感材料最大；且隨著侵染時間延長，種莢霉變程度加劇，Fm和Fv具有明顯的應答響應。

圖2 接種輪枝鐮刀菌后的種莢初始葉綠素熒光參數變化Figure 2 Initial chlorophyll fluorescence parameters changes of soybean pods after inoculation with F.verticillioides

2.3 接種過程中種莢的非光化學猝滅系數

接種輪枝鐮刀菌的5 d內，不同抗性大豆種莢的非光化學猝滅系數qN隨接種時間變化如圖3所示。與對照相比，隨著接種時間的延長，‘QWT15-2’的qN幾乎沒有變化；‘E1’和‘E314’種莢qN不斷增高，且變化幅度明顯大于‘QWT15-2’?！瓻1’種莢qN在接種3 d后呈極顯著變化；而‘E314’種莢qN變化時間更為提前，在接種2 d后呈顯著變化；‘QWT15-2’在整個接種過程中變化都不顯著，表明熒光參數qN在響應時間和變化幅度上，對霉菌侵染應答敏感。

圖3 接種輪枝鐮刀菌后種莢非光化學猝滅系數Figure 3 Non-chemical quenching coefficient changes of soybean pods after inoculation with F.verticillioides

2.4 接種過程中的種莢光化學效率與電子傳遞效率

對接種豆莢的光化學效率與電子傳遞效率進行了時序性監測。由圖4可知：在接種的5 d內，與對照相比，3個不同抗性大豆豆莢的光化學效率ΦPSⅡ與電子傳遞速率RET均呈下降趨勢，但僅在易感材料‘E314’中響應劇烈。

圖4 接種輪枝鐮刀菌后的種莢光化學效率與電子傳遞效率Figure 4 Photochemical efficiency and RET changes of soybean pods after inoculation with F.verticillioides

3 討論

葉綠素熒光成像技術是植物光合生理的無損傷探針，近年來在植物抗逆生理機制和植物病害檢測方面得到了廣泛應用。對水稻[9]、小麥[11]、山葡萄Vitis amurensis[12]等植物的病害研究發現，各種病害均會降低植物Fv/Fm，抑制PSⅡ活性。楊峰等[13]運用熒光成像技術發現，根腐病導致大豆葉片PSⅡ反應中心受到影響，使得Fv/Fm、QNP和ΦPSⅡ下降；何金祥等[14]在煙草Nicotiana tabacum中發現花葉病毒感染葉片時，PSⅡ的光捕獲效率和光化學反應效率降低，光合電子傳遞和碳同化受到抑制，Fv/Fm、QNP和ΦPSⅡ顯著低于健康葉片。表明在生物脅迫檢測中，葉綠素熒光參數Fv/Fm、QNP和ΦPSⅡ等對生物脅迫具有較好的靈敏度，能實現對染病植株與健康植株的早期識別，也能定量分析植株的染病程度。

在本研究中，種莢接種輪枝鐮刀菌后，其熒光參數與對照差異明顯，高抗大豆‘QWT15-2’參數變化幅度最小，其次是中抗大豆‘E1’，易感大豆‘E314’最大。接種后Fo、Fm及Fv呈降低趨勢，Fo為光照下最小熒光，主要與PSⅡ天線色素內的最初激子密度及葉綠素含量有關[15]，由于種莢組織被病原菌破壞，葉綠素含量急劇降低，導致Fo明顯降低；Fm和Fv分別反映了PSⅡ的電子傳遞情況和電子傳遞受體QA的還原情況[16]，與對照相比，接菌后‘E1’和‘E314’的PSⅡ活性下降，電子傳遞速率RET降低。表明霉菌侵染大豆種莢后，會損壞其光合機構，導致電子傳遞受阻，使得種莢初始熒光降低，而‘QWTT15-2’維持了較為健康的組織形態，初始熒光參數表現穩定。在初始熒光中，Fm和Fv在中抗大豆‘E1’和易感大豆‘E314’較早應答病菌侵染，隨著侵染時間延長，種莢霉變程度加劇，Fm和Fv具有明顯的應答響應。

最大光化學效率Fv/Fm及光化學效率ΦPSII的降低也表明種莢受霉菌侵染后，種莢健康組織逐漸受損，其PSⅡ反應中心的原初光能捕獲效率降低，導致實際的光化學效率ΦPSII降低，其中Fv/Fm在3個不同抗性材料中應答最為明顯。非光化學猝滅系數qN和QNP反映了PSⅡ天線色素吸收的光能不能用于光合電子傳遞的部分和植物熱耗散的能力[17]，種莢在霉菌侵染條件下，‘E1’和‘E314’種莢的健康組織逐步霉變，病變處光能未被光合吸收利用，使得天線色素吸收的多余光能以熱能形式耗散掉。在整個接種過程中，‘QWT15-2’種莢qN和QNP變化都不顯著，而‘E1’和‘E314’種莢qN和QNP分別在接種3和2 d后呈顯著變化，表明qN和QNP在響應時間和變化幅度上，對霉菌侵染應答敏感。

因而在上述實驗過程中，高抗大豆‘QWT15-2’在接種病原菌后，種莢各熒光參數變化均不大，僅Fv/Fm變化明顯；中抗大豆‘E1’中，熒光參數下降幅度更為明顯，多個參數在霉變嚴重的4～5 d達到顯著水平，以Fm、Fv、qN和QNP的應答更為明顯；而易感大豆‘E314’種莢在霉菌侵染2 d時，其光系統活性即發生顯著變化，所有熒光參數均發生了極顯著響應。

4 結論

輪枝鐮刀菌侵染大豆種莢后，不同抗性大豆種莢的熒光參數響應迅速。霉菌造成種莢光合機構損傷，葉綠素降解，熱耗散能力降低，阻礙了光合電子傳遞，導致光合速率下降；隨著離體培養時間的延長，病原菌擴散加快、霉變程度加劇，健康種莢組織逐漸被霉菌破壞，使得種莢Fo、Fm、Fv、Fv/Fm、QNP、ΦPSⅡ、RET下降；其中，霉菌侵染不同抗性大豆1 d后，Fv/Fm即有明顯響應，均呈現下降趨勢，可作為篩選抗性大豆種質的首要評價指標；Fm、Fv、qN和QNP在中抗和易感品種中也具有顯著響應，可作為次要評價指標。南方大豆田間霉變嚴重，基于葉綠素熒光成像技術實現對豆莢霉變的早期監測預報具有重要作用，后續工作將擴大檢測群體，進一步驗證熒光參數的應用效果，為抗病新品種選育奠定基礎。