響應面優化超聲波輔助[Bmim]Cl-K2HPO4雙水相提取黃秋葵多糖

何自強，張惠玲，楊正雄

（武漢生物工程學院 化學與環境工程學院，湖北 武漢 430415）

黃秋葵Abelmoschus esculentus，別名咖啡黃葵、秋葵、羊角豆、補腎菜等，為錦葵科Malvaceae秋葵屬Abelmoschus1年生藥食兩用草本植物。目前，全世界均有黃秋葵種植[1-3]。作為一種新型的保健蔬菜，黃秋葵中富含多糖、黃酮、蛋白質、維生素、礦物質以及脂肪等多種生物活性成分，具有較高的食用及藥用價值[4-5]。黃秋葵多糖具有抗疲勞[6]，抗氧化[7]，抗菌，抗癌[8]，降血糖血脂，提高機體免疫力及具有體外結合膽酸的能力等藥理作用[9]。同時，由于具有良好的增稠、乳化等性能，黃秋葵多糖已廣泛用于面制品、肉制品、飲料、冰淇淋等食品的生產中[10-12]。王煒強等[13]研究表明：黃秋葵多糖是一種天然高分子絮凝劑，安全無毒，生物降解性好，在環保領域應用前景廣闊。因此，黃秋葵多糖的開發已成為研究的熱點。超聲輔助提取可加快可溶性黃秋葵多糖的溶出，能避免高溫高壓破壞黃秋葵多糖的成分，且條件溫和、提取時間短、提取效率高[14]。離子液體通常由無機陰離子和有機陽離子組成，室溫時呈液態，離子液體不易揮發、穩定溫度范圍寬、化學穩定性較高、物質溶解性良好、酸性可調[15-17]。離子液體-無機鹽雙水相萃取技術同時結合了離子液體和雙水相的優點，具有分相時間短、無乳化現象、能保持生物分子活性、回收率高等優點，是一種綠色環保的分離方法，已用于生物大分子和天然產物的萃取分離[18-20]。本研究首先采用濁點法分別繪制離子液體[Bmim]Cl與K2HPO4、Na2HPO4、Na2CO3、(NH4)2SO4等4種無機鹽組成的雙水相體系相圖，篩選出[Bmim]Cl-K2HPO4為最佳體系；再利用[Bmim]Cl-K2HPO4雙水相耦合超聲波提取黃秋葵多糖，通過五因素三水平響應面Box-Behnken設計優化單因素試驗，確定黃秋葵多糖的最佳提取工藝條件，以期提高黃秋葵多糖的提取率，為黃秋葵多糖的進一步開發提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃秋葵果：產自山東微山；葡萄糖標準品：質量分數(HPLC)≥98%，上海金穗生物科技有限公司批號20170829；1-丁基-3-甲基咪唑氯鹽([Bmim]Cl)：林州市科能材料科技有限公司，分析純；三水合磷酸氫二鉀：西隴科學股份有限公司，分析純；十二水合磷酸氫二鈉：西隴科學股份有限公司，分析純；無水碳酸鈉：天津博迪化工股份有限公司，分析純；硫酸銨：國藥集團化學試劑有限公司，分析純；苯酚、濃硫酸均為分析純。

1.2 儀器與設備

AUY120型電子天平：日本島津公司；SK3310HP超聲波清洗器(53 kHz，180 W)：上海科導超聲儀器有限公司；TU-1810型紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；SHZ-DⅢ循環水式真空泵：鞏義市英峪予華儀器廠；RE-52AAA型旋轉蒸發器：上海嘉鵬科技有限公司；TG16-WS型臺式高速離心機：長沙湘智離心機儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準曲線的繪制 精確稱取葡萄糖標準品0.020 2 g，蒸餾水溶解后于50 mL容量瓶定容、搖勻，即得質量濃度為0.404 g·L-1的葡萄糖標準溶液。精確移取0.0、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL葡萄糖標準溶液至6支10 mL容量瓶中，依次加入蒸餾水1.0 mL和質量分數為5%苯酚(蒸餾，收集182 ℃餾分)1.0 mL，振蕩搖勻后加5 mL濃硫酸，蒸餾水定容后，于92 ℃水浴中加熱30 min，流水冷卻，于487 nm波長處測其吸光度。用最小二乘法進行回歸分析，得到一元線性回歸方程：y=15.316x-0.001 9，R2=0.999 0。其中：y為吸光度，x為黃秋葵多糖質量濃度。

1.3.2 黃秋葵多糖提取率的計算 采用苯酚-硫酸法測定黃秋葵多糖質量。該法是先以葡萄糖作標準品做出標準曲線，再通過多糖的顯色反應(濃硫酸可使多糖降解為葡萄糖，苯酚再與葡萄糖作用而顯色)測定吸光度，然后根據一元線性回歸方程和稀釋倍數先計算出上相液黃秋葵多糖質量，再計算黃秋葵多糖提取率。

精確移取適量黃秋葵提取上相液于10 mL容量瓶中，其他同1.3.1，測其吸光度。黃秋葵多糖提取率=黃秋葵多糖質量/黃秋葵粉質量×100%

1.3.3 單因素試驗 將黃秋葵果于60 ℃下干燥4 h后，粉碎機中粉碎，過80目篩，保存備用。準確稱取0.5 g黃秋葵粉，置于50 mL碘量瓶中，加入5 mL不同質量分數的[Bmim]Cl溶液和5 mL不同質量分數的K2HPO4溶液形成的雙水相體系中，將5個試驗因素K2HPO4質量分數、提取時間、提取溫度、液固比、[Bmim]Cl質量分數中的4個固定不變，1個作為變量，超聲提取后抽濾，濾液以7 500 r·min-1轉速離心10 min，于分液漏斗中分相，上相液待用。

1.3.4 響應面試驗 在5個單因素試驗得出的最佳條件基礎上，以單因素為自變量，黃秋葵多糖提取率為響應值，設計五因素三水平響應面中心組合試驗。結果見表1。

1.3.5 數據處理及分析 單因素試驗數據采用2010軟件處理；響應面試驗數據采用Design-Expert 8.0.6.1軟件處理，并對數據的顯著性差異進行分析。

表1 Box-Behnken試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

2 結果與討論

2.1 最大吸收波長的確定

分別精確移取葡萄糖標準溶液0.4 mL、黃秋葵提取上相液1.0 mL于10 mL容量瓶，其他操作同1.3.1，可見光區400～800 nm光譜掃描。圖1表明：葡萄糖標準溶液和黃秋葵提取上相液在487 nm處均有最大吸收，故選擇檢測波長為487 nm。

2.2 雙水相體系的選取

2.2.1 雙水相體系分相能力的考察 采用濁點滴定法繪制各雙水相體系相圖，考察離子液體[Bmim]Cl與K2HPO4、Na2HPO4、Na2CO3、(NH4)2SO4等4種無機鹽形成雙水相體系的分相能力[21-23]。室溫20 ℃下，分別準確稱取一定質量的無機鹽于4支試管中，加蒸餾水溶解，再加入一定質量的[Bmim]Cl，直至溶液渾濁，膠頭滴管逐滴滴加蒸餾水至澄清，稱其質量，反復以上操作。計算每次出現渾濁時，無機鹽和[Bmim]Cl的質量分數。分別以無機鹽的質量分數為橫坐標，[Bmim]Cl的質量分數為縱坐標，繪制相圖。

圖2的4條曲線均為雙節線，曲線上的點為臨界點，曲線下方為單相區，不分層，曲線上方為兩相區。由圖2可知，(NH4)2SO4和Na2HPO4的分相能力較差，僅有3個濁點，繼續滴加(NH4)2SO4和Na2HPO4不再出現渾濁，不能與[Bmim]Cl形成穩定的雙水相體系；Na2CO3和K2HPO4與[Bmim]Cl能形成穩定的雙水相體系，但Na2CO3的溶解度受溫度變化影響較大，分相范圍較窄，持續時間較短，而K2HPO4分相范圍廣且持續時間較長。

2.2.2 雙水相體系萃取能力的考察 通過相比、分配系數及提取率等物理量，考察[Bmim]Cl-無機鹽雙水相體系對黃秋葵提取液的萃取能力。準確稱取一定質量的黃秋葵粉，分別加入到5 mL一定質量分數的4種無機鹽(Na2CO3、NaHPO4、(NH4)2SO4、K2HPO4)溶液和5 mL一定質量分數的[Bmim]Cl形成的雙水相體系中，60 ℃水浴中超聲提取(超聲功率180 W)30 min，抽濾，濾液離心后，在分液漏斗中分相。測定上相和下相中黃秋葵多糖的吸光度，計算4種雙水相體系的相比(R)、分配系數(K)及提取率。

圖1 最大波長的確定Figure 1 Determination of maximum wavelength

圖2 雙水相體系相圖Figure 2 Phase diagram of two-phase aqueous system

式(1)～(2)中：Vt、Vb分別為上相、下相溶液體積(mL)；Ct、Cb分別為上相、下相中黃秋葵多糖質量濃度(g·L-1)。

由表2可知：在[Bmim]Cl-(NH4)2SO4和[Bmim]Cl-Na2HPO4雙水相中，提取液不分相；[Bmim]Cl-Na2CO3和[Bmim]Cl-K2HPO4中，提取液分相，但相較而言，[Bmim]Cl-K2HPO4雙水相提取率較大，且黃秋葵多糖主要分布在上相。綜合以上分析，[Bmim]Cl-K2HPO4雙水相有較強的分相能力與萃取能力，因此，選擇[Bmim]Cl-K2HPO4為本試驗的雙水相體系。

表2 不同[Bmim]Cl-無機鹽雙水相體系萃取能力的比較Table 2 Comparison of extraction ability of different [Bmim]-Clinorgnic salts in aqueous two-phase system

2.3 單因素試驗結果

2.3.1 K2HPO4質量分數對黃秋葵多糖提取率的影響 稱取0.5 g黃秋葵粉于50 mL碘量瓶中，在5 mL質量分數為70%的[Bmim]Cl溶液、液固比20 mL·g-1、提取溫度60 ℃、提取時間30 min，5 mL K2HPO4質量分數分別為20%、21%、23%、25%、27%的條件下進行超聲提取(超聲功率180 W)。由圖3可知：隨著K2HPO4質量分數的增大，黃秋葵多糖提取率先增大后減小，質量分數23%時最大。隨著鹽量的增加，富集鹽的下相結構性逐漸增強，容納黃秋葵多糖的空腔形成越困難，而富集離子液體的上相結構性逐漸減弱，容納黃秋葵多糖的空腔越易形成，黃秋葵多糖提取率不斷增大；但質量分數超過23%時，產生鹽效應，黃秋葵多糖提取率逐漸降低。因此，選取23%為K2HPO4適宜的質量分數。

2.3.2 提取時間對黃秋葵多糖提取率的影響

稱取0.5 g黃秋葵粉于50 mL碘量瓶中，在5 mL質量分數為70%的[Bmim]Cl溶液，5 mL質量分數為23%的K2HPO4溶液，液固比20 mL·g-1，提取溫度60 ℃，分別在20、30、40、50、60 min的條件下進行超聲提取(超聲功率180 W)。由圖4可知：隨提取時間增長，黃秋葵多糖提取率增大，30 min時達到最大，但30 min后提取率下降，并趨于平緩。提取時間增長，上相液黏度增大，導致黃秋葵多糖的提取越困難。因此，選取30 min為適宜的提取時間。

圖3 K2HPO4質量分數對黃秋葵多糖提取率的影響Figure 3 Effect of K2HPO4 mass fraction on the extraction rate of okra polysaccharide

2.3.3 提取溫度對黃秋葵多糖提取率的影響 稱取0.5 g黃秋葵粉于50 mL碘量瓶中，在5 mL質量分數為70%的[Bmim]Cl溶液，5 mL質量分數為23%的K2HPO4溶液，液固比20 mL·g-1，提取時間30 min，提取溫度分別為30、40、50、60、70 ℃的條件下進行超聲提取(超聲功率180 W)。由圖5可知：溫度升高，促進了黃秋葵多糖的溶出，提取率增大；但溫度過高，雜質溶出相應增多，提取率反而下降。因此，選取60 ℃為適宜的提取溫度。

圖4 提取時間對黃秋葵多糖提取率的影響Figure 4 Effect of extraction time on the extraction rate of okra polysaccharide

圖5 提取溫度對黃秋葵多糖提取率的影響Figure 5 Effect of extraction temperature on the extraction rate of okra polysaccharide

2.3.4 液固比對黃秋葵多糖提取率的影響 稱取0.5 g黃秋葵粉于50 mL碘量瓶中，在5 mL質量分數為70%的[Bmim]Cl溶液，5 mL質量分數為23%的K2HPO4溶液，提取時間30 min，提取溫度60 ℃，液固比分別為17、20、25、30、34、50 mL·g-1的條件下進行超聲提取(超聲功率180 W)。由圖6可知：隨著液固比的增大，黃秋葵粉與[Bmim]Cl-K2HPO4雙水相接觸面積增加，黃秋葵多糖不斷溶出。液固比超過20 mL·g-1，黃秋葵多糖提取率下降，可能液固比過大，濃縮等操作時間延長，導致黃秋葵多糖損失較多，提取率下降[24]。因此，選取20 mL·g-1為適宜的液固比。

2.3.5 [Bmim]Cl質量分數對黃秋葵多糖提取率的影響 稱取0.5 g黃秋葵粉于50 mL碘量瓶中，在5 mL質量分數為23%的K2HPO4溶液，提取時間30 min，提取溫度60 ℃，液固比20 mL·g-1，[Bmim]Cl質量分數分別為65.0%、67.5%、70.0%、72.5%、75.0%的條件下進行超聲提取(超聲功率180 W)。由圖7可知：隨著[Bmim]Cl量的增大，黃秋葵多糖在上相的富集增多，[Bmim]Cl質量分數72.5%時最大，之后提取率下降，黃秋葵多糖在上相的富集達到飽和。因此，選取72.5%為[Bmim]Cl適宜的質量分數。

圖6 液固比對黃秋葵多糖提取率的影響Figure 6 Effect of liquid-solid ratio on the extraction rate of okra polysaccharide

圖7 [Bmim]Cl質量分數對黃秋葵多糖提取率的影響Figure 7 Effect of [Bmim]Cl mass fraction on the extraction rate of okra polysaccharide

2.4 響應面優化試驗結果

五因素三水平響應面試驗共46組，包括析因試驗(40組)和中心試驗(6組)。析因試驗各不相同，6組因素水平均相同的中心試驗，是重復6次以估算試驗誤差。

對試驗數據進行回歸擬合，得到各單因素與黃秋葵多糖間的二次多元方程：y=27.27-0.13A+0.17B-0.35C+2.99D-1.26E+2.62AB-0.063AC-1.14AD+0.64AE+3.29BC+2.06BD+0.95BE-3.77CD+0.98CE+0.21DE-3.68A2-5.53B2-2.75C2-3.04D2-4.85E2。

分析表3數據可知：模型P＜0.000 1(差異極顯著)，模型對黃秋葵多糖的提取有顯著影響，失擬項P=0.909 7＞0.050 0(差異不顯著)，說明模型擬合程度較好；各單因素與黃秋葵多糖提取率之間呈良好線性關系(R2=0.974 2)，模型能解釋95.35%的黃秋葵多糖提取率的變化；變異系數為4.31%，數據分散程度較小，試驗結果可信，因此該模型可分析和預測黃秋葵多糖的提取結果。由F值大小可推斷5個單因素對黃秋葵多糖提取率顯著性影響的順序：D(液固比)＞E([Bmim]Cl 質量分數)＞C(提取溫度)＞B(提取時間)＞A(K2HPO4質量分數)；由P值大小可推斷：一次項中，D、E對提取率影響極顯著；二次項中，A、B、C、D、E對提取率影響均極顯著；交互項中，AB、BC、BD、CD之間作用對提取率的影響極顯著，AD、BE、CE之間作用對提取率的影響顯著。圖8為各因素交互作用對黃秋葵多糖提取率顯著影響的響應面圖。

通過回歸模型可預測黃秋葵多糖提取的最佳工藝條件為：K2HPO4質量分數22.31%，提取時間29.36 min，提取溫度55.69 ℃，液固比25.00 mL·g-1，離子液體[Bmim]Cl質量分數71.94%。在此條件下，黃秋葵多糖提取率可達29.12%。

2.5 驗證試驗

為實際操作方便，在K2HPO4質量分數22%，提取時間29 min，提取溫度56 ℃，液固比25.00 mL·g-1，離子液體[Bmim]Cl質量分數72%的條件下進行驗證試驗。5次平行試驗的黃秋葵多糖提取率為：30.28%、32.48%、30.24%、32.47%、30.64%，平均值為31.22%，相對標準偏差為3.70%。

3 結論

室溫下分別繪制離子液體[Bmim]Cl與4種無機鹽[(NH4)2SO4、Na2HPO4、Na2CO3和K2HPO4]形成的雙水相體系相圖，通過比較提取后黃秋葵多糖在各體系中的相比、分配系數和提取率，確定[Bmim]Cl-K2HPO4為本實驗的雙水相體系。離子液體-無機鹽雙水相體系對環境無污染，是一種新型綠色的分析方法。

選取5個因素：K2HPO4質量分數、提取時間、提取溫度、液固比和離子液體[Bmim]Cl質量分數進行單因素試驗，以單因素最佳提取條件為基礎進行響應面試驗，超聲波輔助[Bmim]Cl-K2HPO4雙水相提取黃秋葵多糖的最佳工藝可由回歸模型預測。在5 mL離子液體[Bmim]Cl質量分數為71.94%，5 mL K2HPO4質量分數為22.31%的雙水相體系中，提取時間為29.36 min，提取溫度為55.69 ℃，液固比為25.00 mL·g-1的最佳提取條件下，黃秋葵多糖的提取率為29.12%。在該預測最佳工藝基礎上進行5次驗證試驗，黃秋葵多糖提取率平均值為31.22%，相對標準偏差為3.70%。

圖8 各因素交互作用對黃秋葵多糖提取率交互影響的響應面圖Figure 8 Response surface of the interaction of various factors on the extraction rate of polysaccharides from okra