微RNA參與PCI后心肌缺血再灌注損傷防治的研究進展

李童，李學文，米小龍

(1.山西醫科大學，太原 030000； 2.山西白求恩醫院心內科，太原 030000)

目前急性心肌梗死(acute myocardial infraction，AMI)仍是導致我國居民死亡和殘疾的主要病因之一。溶栓治療或直接經皮冠狀動脈介入術(percutaneous coronary intervention，PCI)能及時對缺血心肌進行再灌注，從而限制心肌梗死面積，保持左心收縮功能，降低患者死亡率，是急性ST段抬高型心肌梗死 (ST-segment elevation myocardial infarction，STEMI)最有效的治療方法。盡管如此，AMI的發病率和死亡率仍然較高，5%～10%的患者仍會在PCI后1～2年發生不良心血管事件，研究人員將此歸咎于心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)[1]。即使再成功的PCI也會導致MIRI發生，目前臨床尚無有效方法預防心肌梗死PCI后MIRI。因此關于術后MIRI的防治成為近些年來心血管領域研究的熱點。過去再灌注損傷的心臟保護療法包括使用抗氧化劑、鈣通道抑制劑以及清除炎癥因子等，但其應用于臨床的效果并不好。對MIRI潛在的病理生理機制的研究先后催生出缺血預處理、缺血后處理、遠程缺血預處理和相關藥物治療等策略，許多策略已在實驗室證明有效，部分在臨床應用中表現良好。體內微RNA(microRNA，miRNA)可能是上述治療策略中發揮作用的重要介質和效應分子。現就miRNA參與缺血再灌注損傷后不同類型心肌保護的機制做一綜述。

1 miRNA概述

miRNA是一類廣泛存在于真核生物體內的高度保守的非編碼基因序列，其5′端有磷酸基團，3′端有羥基結構，長度為17～25個核苷酸，其典型特征是具有發夾結構。1993年，Lee等[2]在線蟲體內首次發現能階段性調控胚胎后期發育的基因lin-4，開啟了人類對miRNA認識的大門。在真核細胞中，miRNA的形成過程首先是RNA聚合酶Ⅱ從 miRNA編碼基因轉錄出原始miRNA，長度為300～1 000個堿基；經核酸內切酶ⅢDrosha的加工后，切割成長度為70～100個堿基、具有莖環結構的前體miRNA；前體miRNA轉運至細胞質后，由Dicer酶切成長度為17～25個核苷酸大小的成熟雙鏈miRNA；最后在解螺旋酶的作用下，雙鏈miRNA解開，其中一條鏈被降解，另一條鏈形成RNA誘導沉默復合體，通過作用于與其部分或完全互補的下游靶mRNA，使下游靶mRNA的表達下降或降解，從而調控體內基因表達。miRNA在血漿中能穩定存在且形式多樣，其既能與蛋白質結合，包括脂蛋白如高密度脂蛋白，核糖核蛋白如Ago蛋白；又能包裹在囊泡中以胞外囊泡的形式存在。miRNA根據細胞來源可分為外泌體、微囊泡及凋亡小體[3]。研究發現，miRNA在心臟的多種生理和病理過程中發揮作用，包括心肌梗死、心肌肥厚、心肌纖維化、心律失常、心力衰竭[4-5]。

2 miRNA與缺血預適應

缺血預適應(ischemic preconditioning，IPC)是指在一次長時間致命性心肌缺血發作前，人為造成多次短時間的非致死性缺血再灌注，進而誘導機體產生內源性物質保護心肌，這一現象由Murry等[6]首次發現。隨后在不同種屬動物以及不同組織器官中證實了IPC的心肌保護效應，包括減小心肌梗死面積、降低再灌注心律失常發生率、改善缺血后內皮功能失調。Staat等[7]研究表明，IPC能顯著減小心肌梗死面積。IPC本身即是一種有創的治療方法，且僅適用于缺血事件發生前，但AMI通常很難預料，因此IPC很難運用到臨床。多種miRNA參與了IPC減輕MIRI的機制。Varga等[8]的研究首次揭示了行缺血預處理后MIRI早期機體內miRNA的變化，該研究將大鼠分為三組，即非缺血組，缺血再灌注組(冠狀動脈缺血30 min，再灌注120 min)和缺血預處理組(缺血再灌注前先短暫缺血5 min，再灌注 5 min，往復3次)，通過微陣列分析發現，缺血預處理組中有3種miRNA(miR-139-5p、miR-192和miR-212)的表達水平與缺血再灌注組和非缺血組相比顯著上調，表明這些miRNA是由IPC特異性誘導的。此外，該研究還發現miR-487b在缺血再灌注組顯著上調，而IPC抑制了上調，從而證明IPC在MIRI中不僅能促進心臟保護性miRNA的表達，也能特異性抑制損傷性miRNA的表達。Cheng等[9]發現，MIRI前24 h注射antigomiR-21抑制miR-21的表達能抵消IPC的心肌保護作用。Wang等[10]研究發現，缺乏miR-451的小鼠對IPC作用不敏感，通過注射antigomiR-451能明顯改善這一現象。

3 miRNA與缺血后適應

隨著對MIRI研究的深入和病理生理過程的了解，發現了一種新的減輕MIRI的方法——缺血后適應。雖然相較于IPC，缺血后適應仍是一種有創的治療手段，其是在心肌缺血發生后再灌注治療開始前，實施多次短暫的缺血再灌注處理。Staat等[7]將30例急性STEMI患者分為缺血后適應組和對照組，患者均行PCI治療，缺血后適應組患者行支架置入后行4個循環的短暫缺血再灌注(球囊擴張1 min，恢復血液灌注1 min)治療。結果發現，缺血后適應組患者心肌梗死面積縮小36%，且患者的心肌灌注分級也顯著高于對照組。

目前關于調控缺血后適應的miRNA在心臟保護中的確切作用尚不清楚。miR-499是由肌球蛋白重鏈7B編碼的miRNA，僅在心肌細胞內表達[11]。Zhu等[12]采用基因芯片微陣列分析發現，缺血后適應組與缺血再灌注組有23種miRNA上調，33種miRNA下調，其中miR-499上調最顯著，是缺血再灌注組的8倍多。為確定miR-499的心肌保護作用，向小鼠冠狀動脈內注射antagomiR-499以拮抗內源性miR-499的表達，然后與缺血后適應組相比發現，心肌梗死面積顯著擴大；熒光素酶報告基因檢測顯示miR-499會直接抑制程序性細胞死亡因子(programmed cell death factor，PDCD)4的翻譯，證明PDCD4是miR-499的直接靶點[12]。Wan等[13]發現，與缺血再灌注組相比，缺血后適應組的心肌梗死面積占缺血面積的比例下降，表明缺血后適應可改善心肌功能，減小心肌梗死面積，預防缺血再灌注損傷。進一步研究發現，缺血后適應組miR-214的表達水平顯著上調、缺氧誘導因子-1α抑制因子表達水平下調，認為miR-214可能通過靶向調控缺氧誘導因子-1α抑制因子基因參與缺血后適應的保護作用[13]。也有研究報道，心肌特異性較好的miR-1、miR-133參與了缺血后細胞凋亡進程，兩者在調控細胞凋亡上相互拮抗，心肌缺血后過表達的miR-1可抑制熱激蛋白60和熱激蛋白70的表達，進而促使心肌細胞凋亡，而轉染miR-133可部分阻止心肌細胞的凋亡，其機制可能是miR-133可在多種層面抑制胱天蛋白酶-9的表達[14-15]。He等[16]的研究也表明，缺血后適應通過上調miR-133a的表達，減少心肌細胞凋亡，具體機制可能是miR-133a通過靶向抑制胱天蛋白酶-9的表達，減少心肌細胞凋亡。目前認為miR-21能調控細胞凋亡，屬于抗凋亡基因，人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因和PDCD4是其主要靶點[17]。Tu等[18]研究證實，miR-21能通過人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源/蛋白激酶B信號通路參與缺血后適應介導的心肌保護，抵抗MIRI和功能障礙。

4 miRNA與遠端IPC

遠端IPC(remote ischemic preconditioning，RIPC)是通過在肢體遠端誘導一個或多個短暫非致命的缺血和再灌注循環，從而遠距離保護心臟免受急性心肌缺血再灌注的影響[19]，其通過干預非重要器官達到降低心肌損傷的目的，是一種可行、無創、有效的心肌保護方法，與IPC相比更具臨床應用價值。一般通過使用綁在四肢的血壓袖帶完成充氣和放氣3個 5 min的缺血再灌注循環，即可實現心肌保護作用。RIPC可以預防缺血引起的心肌組織線粒體呼吸功能損傷，減少活性氧類的產生，維持腺苷三磷酸水平，從而減少心肌缺血缺氧損傷[20]。雖然目前大規模臨床研究并未證明RIPC對心肌的保護效應[21]，但一些單中心研究發現，應用RIPC可減少PCI后心臟壞死標志物的釋放，減輕再灌注損傷[22-23]。B?tker等[24]發現，在轉運途中對STEMI患者實施RIPC可顯著改善心肌存活，且僅有一支冠狀動脈閉塞的患者從該治療性干預措施中獲益最大。為研究RIPC保護心肌的內在機制，Slagsvold等[25]將60例冠狀動脈旁路移植術患者隨機分為RIPC組(30例)和對照組(30例)，RIPC組患者術前將上臂血壓袖帶充氣至200 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，持續5 min，后放氣5 min，如此往復3個循環后手術，術后右心耳處活檢測量最大線粒體呼吸商發現，RIPC組術前、術后最大線粒體呼吸商保持不變，而對照組下降28%，提示RIPC能顯著保護再灌注心肌組織；通過定量逆轉錄聚合酶鏈反應檢測miRNA的表達情況發現，RIPC組miR-1的表達下調，而對照組miR-1顯著上調，認為RIPC可能是通過抑制右心房心肌miR-1的表達，改善線粒體呼吸功能，減少心肌缺血缺氧損傷。國內有學者將165例冠心病患者隨機分為試驗組和對照組，試驗組患者于入院后第2、3、4天上午、下午各進行1次RIPC治療，所有患者于入院第5天行擇期PCI，測定入院第2天和第5天miR-21的表達情況發現，兩組患者入院后第2天血漿miR-21的水平比較差異無統計學意義，而第5天血漿miR-21的水平比較差異有統計學意義，其中試驗組第5天血漿miR-21的水平較第2天明顯上升，而對照組則無明顯變化，據此認為RIPC能上調冠心病患者血漿miR-21的水平，減輕冠狀動脈再灌注損傷程度[26]。

5 miRNA參與藥物相關的心臟保護機制

MIRI在圍手術期發生頻繁，包括心臟和非心臟手術，可導致心肌細胞凋亡和壞死，是圍手術期死亡的重要原因。阿片類藥物作為圍手術期鎮痛方案的一個組成部分，無論是在全身麻醉期間還是局部使用阿片類藥物預處理和后處理對心臟均有強大的保護作用[27]。將分離的成年大鼠心肌細胞按不同處理方法分為空白對照組，缺氧再灌注組和嗎啡處理組，結果顯示，缺氧再灌注組細胞損傷嚴重，與對照組相比心肌細胞活力明顯降低，乳酸脫氫酶水平和細胞死亡數增加，而嗎啡能顯著保護心肌細胞免受缺氧再灌注損傷，細胞活力提高，乳酸脫氫酶水平和細胞死亡數降低；微陣列分析顯示，嗎啡處理組miR-133b-5p的表達明顯上調，雙熒光素基因報告證實Fas是miR-133b-5p的下游靶基因；將miR-133b-5p模擬物或抑制劑分別轉染心肌H9C2細胞，證明miR-133b-5p通過抑制Fas基因的表達，在嗎啡介導的心肌保護作用中發揮重要作用[28]。除阿片類藥物外，心臟保護藥還包括調節再灌注損傷細胞信號通路的藥物，如腺苷、心房鈉尿肽、阿托伐他汀、促紅細胞生成素、艾塞那肽、極化液等。PCI后3 h內靜脈滴注腺苷可能對STEMI患者臨床預后有有益作用[29-30]。環孢霉素A可通過抑制線粒體膜通透性轉換孔的開放而發揮心肌保護效應[31]，后者是介導致死性缺血再灌注損傷的關鍵因素。一項臨床研究顯示，STEMI患者行PCI前予以靜脈注射環孢霉素A可明顯減小心肌梗死面積，減少心室重構等不良反應[32]。目前關于使用上述藥物后體內miRNA表達情況的研究較少，未來可進一步針對藥物對體內miRNA表達的影響進行研究。

6 展 望

盡管直接PCI和溶栓等方法能夠早日實現急性STEMI相關血管的再灌注，但MIRI仍是影響急性STEMI患者血運重建獲益的重要因素。針對PCI后MIRI防治的研究已從機械治療策略如缺血預處理、缺血后處理、遠端缺血預處理和相關藥物治療策略發展至調控機體內源性小分子物質如腺苷、腫瘤壞死因子-α、細胞間黏附分子-1、熱激蛋白70、線粒體乙醛脫氫酶2等的表達[33]，隨著時間的推移，越來越多新的MIRI和心臟保護靶點正在被確定。近年來miRNA在MIRI和心臟保護方面的價值已引起人們的關注，許多已被證明是心臟病的生物標志物或用于預防心肌梗死、心力衰竭的潛在治療靶點。通過上調或下調相應miRNA的表達能起到心肌保護的效果。不同治療策略引起體內miRNA的表達趨勢也不相同，同一種心肌保護方法也能引起不同種類miRNA表達水平的改變，且一種miRNA通常有多個下游靶點，正是miRNA的這些特點使得有望改善AMI患者的預后。

miRNA真正用于臨床實踐還存在一些困難，一方面是目前研究的與MIRI相關的miRNA心肌特異性不高；另一方面目前僅有極少部分的實驗室結果與臨床試驗結果一致，原因可能是不恰當的實驗動物模型、不確定療法的臨床測試以及不恰當的臨床試驗設計。現階段正在進行以納米顆粒、病毒和外泌體作為載體的研究，以改善miRNA的組織特異性，并提高心肌對miRNA的生物利用度，以促進臨床成果轉化。相信隨著對MIRI機制研究的深入及相關臨床試驗的開展，有望找到可有效防治MIRI的miRNA，最大化再灌注治療的獲益，改善AMI患者的預后。