血清嗜酸粒細(xì)胞來(lái)源神經(jīng)毒素與陽(yáng)離子蛋白對(duì)兒童早期喘息性疾病再發(fā)喘息的預(yù)測(cè)價(jià)值

朱蕾，殷勇，趙麗霞，劉世英，王東

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心呼吸內(nèi)科，上海200127)

喘息是兒童時(shí)期最常見(jiàn)的呼吸道癥狀之一，兒童喘息性疾病的表現(xiàn)形式多樣，是一種異質(zhì)性疾病。近年來(lái)喘息性疾病發(fā)生率在全球范圍內(nèi)呈明顯上升趨勢(shì)。國(guó)外資料顯示，大約1/3的兒童在3歲前至少有過(guò)1次喘息[1]。大部分嬰幼兒早期喘息發(fā)作是暫時(shí)的，隨著肺部的發(fā)育和免疫功能的成熟，大部分嬰幼兒喘息發(fā)作會(huì)完全緩解，據(jù)2000年中國(guó)城區(qū)兒童哮喘流行病學(xué)資料顯示，70%的哮喘兒童喘息首發(fā)于嬰幼兒期[2]。支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱哮喘)是兒童時(shí)期最常見(jiàn)的慢性氣道炎癥性疾病，臨床表現(xiàn)為反復(fù)的喘息、咳嗽、胸悶和氣促。近年來(lái)哮喘的全球總體患病率呈上升趨勢(shì)，哮喘患病率由1990年的1.00%上升到2000年的1.54%，到2010年上升到3.02%，2010年哮喘患兒的現(xiàn)患率、累計(jì)患病率與2000年相比分別增加了50.6%和53.3%[2-4]。大量研究表明，哮喘是嗜酸粒細(xì)胞(eosinophil,EOS)浸潤(rùn)為主，由免疫球蛋白(immunoglobulin E，IgE)介導(dǎo)，伴隨氣道高反應(yīng)為特征的慢性氣道炎癥性疾病[5-7]。EOS的分泌活動(dòng)主要是通過(guò)顆粒蛋白的釋放，包括嗜酸粒細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白(eosinophil cationic protein,ECP)、嗜酸粒細(xì)胞來(lái)源神經(jīng)毒素(eosinophil-derived neurotoxin,EDN)、堿性蛋白和EOS過(guò)氧化物酶，這些蛋白可引起組織損傷和氣道炎癥的播散。研究表明，EDN和ECP幾乎只由EOS所分泌[8]，因此EDN和ECP水平的任何變化可直接反映EOS的炎癥反應(yīng)。本研究試圖探究早期喘息患兒血清EDN、ECP、IgE和EOS水平，探討一種無(wú)創(chuàng)的氣道炎癥檢測(cè)手段，對(duì)早期喘息嬰幼兒進(jìn)行評(píng)估，早期識(shí)別有發(fā)展為哮喘傾向的喘息患兒，以利于喘息患兒的早期干預(yù)和早期治療。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年7月至2017年3月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心呼吸科住院的60例早期喘息患兒，年齡3～12月齡，隨訪觀察1年，根據(jù)出院1年后患兒是否再發(fā)喘息以及再發(fā)喘息的次數(shù)分為復(fù)發(fā)喘息組(32例)和非復(fù)發(fā)喘息組(28例)。其中復(fù)發(fā)喘息組男21例，女11例，年齡平均(4.4±2.2)個(gè)月；非復(fù)發(fā)喘息組男17例，女11例，年齡平均(5.6±2.9)個(gè)月。兩組患兒性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。急性毛細(xì)支氣管炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)符合《毛細(xì)支氣管炎診斷、治療與預(yù)防專家共識(shí)(2014年版)》[9]。

1.2研究方法

1.2.1樣本采集 無(wú)菌采集患兒外周靜脈血3 mL，室溫凝固30 min后，以離心半徑15 cm,3 000 r/min離心15 min，仔細(xì)吸取血清至少500 μL,放置于-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2血清EDN和ECP測(cè)定 采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法分別檢測(cè)血清EDN和ECP水平，見(jiàn)圖1和圖2。EDN試劑盒購(gòu)自日本MBL公司，ECP試劑盒購(gòu)自武漢華美公司，高速離心機(jī)(5810R型)購(gòu)自美國(guó)Eppendorf公司，酶標(biāo)儀(Multiskan FC型)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，恒溫箱(LRHS-300-II)購(gòu)自上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠。

1.2.3血清IgE和EOS測(cè)定 采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法測(cè)定血清總IgE水平。采用美國(guó)Beckman Conlter公司自動(dòng)檢測(cè)機(jī)(EPICSXL型)對(duì)血細(xì)胞五分類計(jì)數(shù)，EOS計(jì)數(shù)正常值為(0.02～0.5)×109/L，EOS百分比正常值為0%～5%。

ECP：嗜酸粒細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白

EDN:嗜酸粒細(xì)胞來(lái)源神經(jīng)毒素

2 結(jié) 果

2.1兩組血清EDN、ECP、IgE、EOS計(jì)數(shù)比較 復(fù)發(fā)喘息組血清EDN、ECP、IgE水平高于非復(fù)發(fā)喘息組(P<0.05)，兩組血清EOS計(jì)數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.2EDN預(yù)測(cè)再發(fā)喘息的ROC曲線 EDN預(yù)測(cè)喘息患兒是否再發(fā)喘息的ROC曲線下面積為 0.643,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.047)，Youden指數(shù)最大值為0.276，其所對(duì)應(yīng)的EDN最佳診斷界值為28.32 μg/L,靈敏度為56.2%，特異度為71.4%，見(jiàn)圖3。

表1 兩組早期喘息患兒血清EDN、ECP、IgE、EOS比較

EDN：嗜酸粒細(xì)胞來(lái)源神經(jīng)毒素；ECP：嗜酸粒細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白；IgE:免疫球蛋白E；EOS：嗜酸粒細(xì)胞；a為t值，余為Z值

EDN：嗜酸粒細(xì)胞來(lái)源神經(jīng)毒素；ROC：受試者工作特征曲線

2.3ECP預(yù)測(cè)再發(fā)喘息的ROC曲線 ECP預(yù)測(cè)喘息患兒是否再發(fā)喘息的ROC曲線下面積為0.656,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.029)，Youden指數(shù)最大值為0.33，其所對(duì)應(yīng)的ECP最佳診斷值為23.41 μg/L,靈敏度為43.7%，特異度為89.3%，見(jiàn)圖4。

2.4IgE預(yù)測(cè)再發(fā)喘息的ROC曲線 IgE預(yù)測(cè)喘息患兒是否再發(fā)喘息的ROC曲線下面積為0.767,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，Youden指數(shù)最大值為0.495，其所對(duì)應(yīng)的IgE最佳診斷值為19 kU/L,靈敏度為78.1%，特異度為71.4%，見(jiàn)圖5。

2.5EDN、ECP、IgE三者ROC曲線下面積比較 ECP與EDN的ROC曲線下面積比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義(Z=0.127，P=0.899)，ECP與IgE的ROC曲線下面積比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=1.231，P=0.218)，EDN與IgE的ROC曲線下面積比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=1.363，P=0.173)。見(jiàn)圖6。

ECP：嗜酸粒細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白；ROC：受試者工作特征曲線

IgE：免疫球蛋白E；ROC：受試者工作特征曲線

EDN：嗜酸粒細(xì)胞來(lái)源神經(jīng)毒素；ECP：嗜酸粒細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白；IgE:免疫球蛋白E；ROC：受試者工作特征曲線

圖6 EDN、ECP、IgE三者ROC曲線下面積比較

3 討 論

嬰幼兒喘息是兒科常見(jiàn)的一種臨床癥狀，引起喘息的病因多種多樣，發(fā)病機(jī)制也十分復(fù)雜。哮喘患兒往往在嬰幼兒期即出現(xiàn)喘息癥狀，但大部分嬰幼兒喘息并不會(huì)發(fā)展為哮喘。Saglani等[10]研究發(fā)現(xiàn)，10個(gè)月齡嬰幼兒喘息患兒已經(jīng)出現(xiàn)氣道重塑及嗜酸粒細(xì)胞性氣道炎癥。哮喘是一種由多種因素引起的異質(zhì)性疾病，目前對(duì)于哮喘的診斷仍比較困難。年長(zhǎng)兒可通過(guò)肺功能檢查進(jìn)行確診，而對(duì)于嬰幼兒目前仍缺乏客觀的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。哮喘是由多種細(xì)胞介導(dǎo)的氣道慢性炎癥性疾病，包括EOS、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、上皮細(xì)胞等，其中以EOS浸潤(rùn)為主要特征。EOS通過(guò)釋放顆粒蛋白、白三烯等細(xì)胞因子引起氣道上皮損傷，支氣管收縮等導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性、氣道受損,從而引起臨床的反復(fù)咳嗽、喘息、氣促和胸悶等癥狀[11]。

Kim等[12]研究結(jié)果表明，與EOS計(jì)數(shù)相比，EOS的脫顆粒產(chǎn)物EDN和ECP更能準(zhǔn)確地反映EOS的活動(dòng)。本研究結(jié)果顯示，復(fù)發(fā)喘息組和非復(fù)發(fā)喘息組EOS計(jì)數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與上述研究結(jié)果相符，提示EOS計(jì)數(shù)在預(yù)測(cè)喘息患兒再發(fā)喘息方面可能不是一個(gè)很好的客觀指標(biāo)。Sedgwick等[13]研究發(fā)現(xiàn)，哮喘患者的EOS有更多的EDN，當(dāng)EOS受到巨噬細(xì)胞集落刺激因子、白細(xì)胞介素-5激活后，大量的EDN隨著EOS的脫顆粒而釋放，進(jìn)而對(duì)氣道造成嚴(yán)重的損傷。Snijders等[14]研究表明，EOS分泌的ECP可介導(dǎo)氣道上皮和細(xì)胞破壞，誘導(dǎo)肥大細(xì)胞釋放組胺等造成氣道炎癥，在EOS性炎癥中起重要作用。

研究表明，ECP可作為EOS的活化標(biāo)志物，ECP水平是客觀反映氣道炎癥活動(dòng)指標(biāo)之一[15-17]。Boumendjel等[18]研究表明，血清ECP水平是一個(gè)很好的哮喘生物學(xué)標(biāo)志物，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)ECP水平的變化可有助于判斷呼吸道炎癥的活動(dòng)和嚴(yán)重程度、預(yù)測(cè)疾病的發(fā)作，以及評(píng)估治療效果。本研究結(jié)果顯示，復(fù)發(fā)喘息組患兒血清ECP水平高于非復(fù)發(fā)喘息組(P<0.05)。本研究ROC曲線得出，ECP對(duì)嬰幼兒早期喘息再發(fā)喘息具有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值，對(duì)應(yīng)的靈敏度為43.7%，特異度為89.3%，與以往國(guó)內(nèi)外的多數(shù)文獻(xiàn)觀點(diǎn)相符[19-22]。路明等[19]研究發(fā)現(xiàn)，哮喘組及喘息性支氣管炎組患兒血清ECP水平均明顯高于對(duì)照組，而哮喘組與喘息性支氣管炎組患兒血清ECP水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Miyoshi[20]檢測(cè)了33例喘息嬰兒血清ECP水平，并對(duì)33例患兒隨訪3個(gè)月，發(fā)現(xiàn)發(fā)展成哮喘患兒血清ECP水平明顯增高，且最初血清ECP>20 μg/L的所有17例患兒均發(fā)展成了哮喘；Koller等[21]研究發(fā)現(xiàn)，首次喘息發(fā)作嬰幼兒組血清ECP水平明顯高于對(duì)照組，且隨訪1年后發(fā)現(xiàn)發(fā)展成哮喘的患兒最初血清ECP水平顯著高于未發(fā)展成哮喘的患兒。陳運(yùn)生等[22]檢測(cè)了32例毛細(xì)支氣管炎兒童急性期、緩解期及肺炎患兒血清ECP水平變化，結(jié)果表明急性期毛細(xì)支氣管患兒血清ECP水平明顯高于肺炎組，且緩解期水平較急性期明顯下降。

本研究結(jié)果顯示，復(fù)發(fā)喘息組患兒血清EDN水平明顯高于非復(fù)發(fā)喘息組(P<0.05)。根據(jù)ROC曲線得出，EDN對(duì)于嬰幼兒早期喘息再發(fā)喘息具有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值，對(duì)應(yīng)的靈敏度為56.2%，特異度為71.4%。有項(xiàng)研究納入了150例年齡為6～24個(gè)月齡的急性呼吸道合胞病毒感染細(xì)支氣管炎患兒，分為試驗(yàn)組(每晚服用4 mg孟魯司特顆粒)和安慰劑組，主要終點(diǎn)指標(biāo)為血清EDN水平和出院后12個(gè)月內(nèi)再發(fā)喘息和喘息次數(shù)情況，結(jié)果表明，以53 μg/L為EDN升高的臨界點(diǎn)，3個(gè)月血清EDN水平對(duì)12個(gè)月復(fù)發(fā)喘息次數(shù)的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為57%，陰性預(yù)測(cè)值為76%，靈敏度為72%，特異度為62%，表明EDN水平是診斷和監(jiān)測(cè)嬰幼兒喘息的重要生物學(xué)標(biāo)志物，此外，3個(gè)月時(shí)的高血清EDN水平可能是預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)性喘息/哮喘發(fā)展的生物學(xué)標(biāo)志物[23]。

流行病調(diào)查提示，哮喘病例中約50%伴有過(guò)敏[24]。Sherrill等[25]研究表明，兒童早期的過(guò)敏狀態(tài)是以后發(fā)展為喘息癥狀的主要危險(xiǎn)因素。有研究表明，早期對(duì)吸入性變應(yīng)原過(guò)敏并且反復(fù)喘息的兒童，將來(lái)進(jìn)展為持續(xù)性哮喘的危險(xiǎn)性明顯增加[26]。本研究結(jié)果顯示，復(fù)發(fā)喘息組嬰幼兒血清IgE水平高于非復(fù)發(fā)喘息組(P<0.05)，提示過(guò)敏因素在嬰幼兒喘息進(jìn)程中的重要作用。根據(jù)ROC曲線得出，IgE對(duì)于嬰幼兒早期喘息再發(fā)喘息具有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值，對(duì)應(yīng)的靈敏度為78.1%，特異度為71.4%。有研究表明，哮喘患兒體內(nèi)總IgE水平有不同程度的升高，說(shuō)明嬰幼兒喘息性疾病與哮喘之間可能有共同的免疫學(xué)發(fā)生機(jī)制，喘息性疾病能否演變?yōu)橄梢詫胗變簳r(shí)期喘息發(fā)作時(shí)的血清IgE水平作為一個(gè)重要的臨床參數(shù)[27]。

綜上所述，早期嬰幼兒喘息患兒血清EDN、ECP和IgE可作為復(fù)發(fā)喘息的預(yù)測(cè)指標(biāo)，可用來(lái)預(yù)測(cè)嬰幼兒喘息復(fù)發(fā)，其中ECP在預(yù)測(cè)喘息復(fù)發(fā)中特異度最高，靈敏度最低，而IgE靈敏度最高，特異度最低，因此，同時(shí)檢測(cè)ECP和IgE可能更好地預(yù)測(cè)早期嬰幼兒喘息再發(fā)喘息的風(fēng)險(xiǎn)。