乳腺癌中SIRT5、PKM2及HK2的表達及其意義

賀 帥，劉欣媛，馬俊兵，張文蓮，齊 琦

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，其發病率和病死率呈逐年升高的趨勢，且發病年齡年輕化[1]。糖代謝異常在乳腺癌的發生、發展中發揮重要作用，有氧糖酵解對糖代謝異常具有重要意義[2]，而腫瘤細胞有氧糖酵解活躍過程中糖酵解關鍵酶表達水平增高，如己糖激酶-2(hexokinase-2, HK-2)、M2型丙酮酸激酶(pyruvate kinase M2, PKM2)[3]，SIRT5作為Sirtuins家族中的獨特成員，對糖酵解關鍵酶具有翻譯后修飾作用[4]。因此，SIRT5可能通過影響乳腺癌糖代謝異常參與乳腺癌的發生、發展。本文檢測乳腺癌組織及癌旁正常組織中SIRT5、PKM2及HK2的表達及相關性，探討SIRT5的過表達對乳腺癌的發生、發展及預后的價值，為SIRT5可能通過有氧糖酵解影響乳腺癌的發生、發展奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料收集包頭醫學院第一附屬醫院2014年1月～2019年2月具有明確病理診斷的乳腺癌患者術后標本130例，患者術前未接受任何治療，年齡27～78歲，平均54歲。130例乳腺癌患者中，<50歲者45例，≥50歲者85例；腫瘤最大徑≤2 cm者50例，>2 cm者80例；伴腋窩淋巴結轉移者40例，無腋窩淋巴結轉移者90例；組織學分級：Ⅰ級20例，Ⅱ級94例，Ⅲ級16例；TNM分級：Ⅰ期20例，Ⅱ期94例，Ⅲ期16例。

兔多克隆抗體SIRT5、HK2、PKM2、GADPH及過氧化物酶標記的羊抗兔抗體購自北京博奧森公司；SIRT5、HK2、PKM2及GADPH引物委托上海吉凱基因公司合成；RNA逆轉錄試劑盒購自Takara公司。

1.2 免疫組化采用免疫組化SP法染色，標本均經10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，并制成5 μm厚切片，參考文獻[5]經0.3% H2O2的PBS中孵育30 min，以阻斷內源性過氧化物酶的活性，2%的正常羊血清37 ℃溫育1 h以封閉非特異性抗體結合位點，加入兔抗人多克隆抗體SIRT5、HK2及PKM2經4 ℃過夜，用過氧化物酶標記的羊抗兔二抗37 ℃溫育1 h，DAB顯色。

1.3 結果判斷Olympus CX21鏡下觀察染色結果，SIRT5、HK2以細胞質或細胞膜有棕色顆粒為陽性；PKM2以細胞核或細胞質內有棕色顆粒為陽性，免疫組化結果判讀：腫瘤細胞無著色為陰性(-), 陽性細胞數<30%為弱陽性(+)，30%～70%為中等陽性()，>70%為中～強陽性()。隨機抽取20個樣本(包括乳腺癌及癌旁正常組織)進行分析，每個樣本隨機選取5個高倍視野(200×)拍照，應用Image pro plus圖像分析軟件分析光密度值，配對比較癌組織與癌旁正常組織的差異。

1.4 RT-PCR檢測乳腺癌SIRT5、PKM2及HK2 mRNA的表達Trizol裂解乳腺癌及癌旁正常組織，提取總RNA，測定濃度，以1 μg RNA為模板，選取SIRT5反轉錄引物，并以GAPDH作內參，引物序列如下。GAPDH正義鏈：5′-TGACTTCAACAGCG ACACCCA-3′，反義鏈：5′-CACCCTGTTGCTGTAGC CAAA-3′；SIRT5正義鏈：5′-TAGAAAGCAGCCGTG GAGAC-3′，反義鏈：5′-AATCAATCGACTTGGGACA A-3′；PKM2正義鏈：5′-GGTGTTTGCGTCATTCATC C-3′，反義鏈：5′-ACCGTCCAATCATCATCTTCTG-3′；HK2正義鏈5′-GAGCCAC CACTCACCCTACT-3′，反義鏈：5′-CCAGGCATTCGGCAATGTG-3′；利用反轉錄酶合成cDNA，1 ∶100稀釋cDNA，取2 μL進行RT-PCR，檢測SIRT5、PKM2及HK2 mRNA的表達。采用相對定量的2-ΔΔCt法進行數據分析。

2 結果

2.1 乳腺癌及癌旁正常組織中SIRT5、PKM2及HK2的表達免疫組化染色顯示：SIRT5、PKM2及HK2陽性染色為細胞質彌漫分布棕黃色顆粒，且乳腺癌組織中的表達高于癌旁正常組織，隨機選取20個標本進行光密度值檢測，平均光密度值分別為(5 824.4±163.1)vs(2 629.9±132.3)、(5 980.3±232.2)vs(2 164.9±121.3)、(6 005.1±197.5)vs(2 196.7±155.4)；乳腺癌組織中SIRT5、PKM2及HK2的平均光密度值均顯著高于癌旁正常組織(P<0.01，表1，圖1)。RT-PCR結果顯示：乳腺癌組織中SIRT5、PKM2和HK2 mRNA表達顯著高于癌旁正常組織，差異有統計學意義(P<0.01，圖2)。

表1 乳腺癌和癌旁正常組織中SIRT5、PKM2及HK2的平均光密度值

圖1 A.SIRT5在乳腺癌組織中的表達，SP法；B.PKM2在乳腺癌組織中的表達，SP法；C.HK2在乳腺癌組織中的表達，SP法；D.SIRT5在癌旁正常組織中的表達，SP法；E.PKM2在癌旁正常組織中的表達，SP法；F.HK2在癌旁正常組織中的表達，SP法

圖2 RT-PCR檢測SIRT5、PKM2及HK2在乳腺癌及癌旁正常組織中的表達

2.2 SIRT5高表達與乳腺癌臨床病理特征的關系將乳腺癌患者依據年齡、腫瘤大小、有無淋巴結轉移及組織學分級等臨床特征進行分組，結果發現乳腺癌患者在不同年齡、淋巴結轉移、TNM分期、ER及PR表達下SIRT5的陽性率差異無統計學意義(P=0.859，P=0.248，P=0.986，P=0.489，P=0.882)；在不同腫瘤大小、組織學分級及HER-2表達下SIRT5的陽性率差異有統計學意義(P=0.003，P=0.001，P=0.037，表2)。

表2 乳腺癌中SIRT5表達與臨床病理特征的關系

2.3 乳腺癌中SIRT5與PKM2、HK2表達的相關性免疫組化結果表明，SIRT5陽性為細胞質有中等或強的棕色顆粒，SIRT5的表達與PKM2(P<0.01)及HK2(P<0.01)的表達呈正相關(表3、4)。

表3 乳腺癌中SIRT5與PKM2表達的相關性

表4 乳腺癌中SIRT5與HK2表達的相關性

3 討論

乳腺癌是女性高發惡性腫瘤，其發生、發展與糖代謝異常密切相關。糖代謝異常所致的高血糖環境下，缺氧誘導因子(hypoxia inducible factor, HIF)通過激活葡萄糖轉運蛋白(glucose transporter, GLUT)及糖酵解基因的表達，使腫瘤細胞攝入大量葡萄糖以加強糖酵解，使腫瘤細胞有充足的ATP[3]；而活躍的糖酵解使HIF1α過表達，促進腫瘤發生、發展；糖酵解產生的大量乳酸，為糖異生提供原料，同時導致外周組織對葡萄糖的利用障礙[2]，因此有氧糖酵解和糖代謝異常相互作用促進腫瘤的發生、發展。因此，調控有氧糖酵解及糖代謝異常，可能為乳腺癌的預防和治療提供重要途徑。最近的研究顯示HK2和PKM2在有氧糖酵解的建立以及腫瘤發生、發展及轉移中起重要作用[4,6]。

Sirtuin蛋白家族是一種NAD+依賴的蛋白去乙酰化酶和(或)ADP 核糖基轉移酶，與糖脂代謝密切相關[7]；SIRT5是Sirtuins家族中的獨特成員，具有NAD+依賴的去乙酰化、去丙二酰化、去琥珀酰化以及去戊二酰化活性[7-9]，其中去丙二酰化涉及糖酵解過程中關鍵酶的修飾[4]；并通過去丙二酰化及去琥珀酰化增強糖酵解[4]。體外實驗證實，提高葡萄糖濃度，SIRT5可誘導HEK-293細胞糖酵解增加[10]。研究報道，SIRT5在基底細胞癌[11]、非小細胞肺癌[12]中可能發揮了癌基因的作用[7]。

本組實驗結果顯示，SIRT5在乳腺癌組織中高表達，與有氧糖酵解關鍵酶PKM2及HK2呈正相關，陽性表達部位均為細胞質，且SIRT5與乳腺癌組織大小、組織學分級及HER-2表達密切相關，SIRT5的過表達對判斷乳腺癌的發生、發展及預后具有一定價值。SIRT5具有翻譯后修飾作用[13-14]，在免疫代謝研究中，SIRT5高表達，細胞質中PKM2呈四聚體形式，沉默SIRT5，使PKM2琥珀酰化水平增高，PKM2由四聚體變為二聚體，進入細胞核，促進巨噬細胞糖酵解。由此推斷，SIRT5可能通過翻譯后修飾作用影響有氧糖酵解關鍵酶PKM2及HK2的活性，增強糖酵解，促進乳腺癌細胞糖代謝異常改變，維持腫瘤微環境，本實驗為進一步探討SIRT5可能通過影響有氧糖酵解促進乳腺癌的發生、發展奠定基礎。