腦脊液細(xì)胞蠟塊技術(shù)在腦膜癌病診斷中的應(yīng)用

張巧全，余 年，王 娟，朱海青

腦膜癌病(meningeal carcinomatosis, MC)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移癌的一種特殊類型，其診斷依賴于反復(fù)多次腦脊液(cerebrospinal fluid, CSF)的細(xì)胞學(xué)檢查；目前國內(nèi)多采用玻璃管離心法收集CSF細(xì)胞，經(jīng)MGG染色或免疫細(xì)胞化學(xué)(immunocytochemistry, ICC)后鏡檢而診斷[1]。但患者常由于各種原因?qū)е虏荒芏啻潍@取CSF標(biāo)本或?qū)δX組織活檢，從而對(duì)疾病診斷及分子分型造成困難。Nathan等[2]研究發(fā)現(xiàn)，惡性胸腔積液患者細(xì)胞蠟塊制備能部分或全部代替組織標(biāo)本，對(duì)疾病的診斷、惡性腫瘤的組織分型及進(jìn)一步分子分型作出判斷。目前尚未有CSF細(xì)胞蠟塊技術(shù)的文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)26例臨床及CSF病理細(xì)胞學(xué)明確診斷的MC患者的CSF，應(yīng)用CSF細(xì)胞蠟塊制備對(duì)MC診斷的回顧性評(píng)估及技術(shù)探討。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源收集南京醫(yī)科大學(xué)附屬腦科醫(yī)院2014年1月～2019年3月期間收治的26例MC患者，其中男性16例，女性10例；年齡范圍16～92歲，平均54.5歲。臨床表現(xiàn)：頭痛、頭暈、嘔吐者11例，抽搐、意識(shí)障礙、認(rèn)知功能減退為主要表現(xiàn)者7例，以復(fù)視或視物成雙、聽力下降、面神經(jīng)麻痹為主要表現(xiàn)者6例，以肢體無力疼痛、小便障礙為主要表現(xiàn)者2例。入組標(biāo)準(zhǔn)[1]：(1)既往有腫瘤病史或者本次入院檢查發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)性腫瘤；(2)具有腦部、顱神經(jīng)、脊髓等受累的一組或多組臨床表現(xiàn)和體征；(3)輔助檢查至少具備下列特征之一：①腰部穿刺顯示顱內(nèi)壓增高，CSF蛋白增高，激活的單核細(xì)胞計(jì)數(shù)增高；②頭顱MRI示腦膜增厚或腦膜線狀、條索狀強(qiáng)化；(4)CSF病理細(xì)胞學(xué)或ICC染色發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞，或存在與原發(fā)腫瘤一致的腫瘤細(xì)胞或cDNA。

1.2 細(xì)胞蠟塊制備應(yīng)用正常血漿在CSF制備蠟塊方法：由于CSF蛋白含量較少，高速離心后很難形成肉眼可見的沉淀。加入正常人血漿后可適量增加CSF的蛋白含量，且血漿中纖維成分較高，易于制塊。乙醇為還原劑[3]，能沉淀白蛋白、球蛋白、核蛋白和纖維蛋白。CSF細(xì)胞蠟塊制備步驟：CSF和血漿按4 ∶1比例充分混勻，加入80%乙醇0.5 mL，用加液槍(或吸管)輕輕打勻；3 000 r/min，15 min，用一次性吸管，吸除上清液，再用加液槍(或吸管)緩慢加入2.5%戊二醛(或10%中性福爾馬林)固定，置入4 ℃冰箱。按常規(guī)石蠟包埋制備蠟塊，參考本課題組既往方法制備[4]。

1.3 ICC染色在細(xì)胞蠟塊中的應(yīng)用ICC染色步驟：石蠟切片機(jī)將細(xì)胞蠟塊連續(xù)2.0～3.0 μm厚切片，服貼于防脫載玻片上；60 ℃烤片1 h，二甲苯脫蠟，梯度乙醇至水化。首先抗原修復(fù)，3%H2O2處理2 min；PBS液沖洗，采用SP法染色(抗體購自北京中杉金橋公司)：一抗室溫孵育2 h，PBS液沖洗，二抗室溫孵育30 min，PBS液沖洗，DAB顯色。PBS代替一抗作陰性對(duì)照，蘇木精復(fù)染，封固。免疫組化染色細(xì)胞均著色好，易于鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 傳統(tǒng)CSF細(xì)胞免疫組化染色常規(guī)CSF MGG染色(圖1A)、ICC染色(圖1B、C)、HE染色(圖1D)顯示腫瘤細(xì)胞數(shù)目較少，背景染色深而不易觀察，此外樣本無法長期保存，臨床診斷需多次重復(fù)穿刺CSF送檢，3例患者初次CSF發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞，7例患者第2次CSF發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞，9例患者第3次，7例患者第4次發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞。

2.2 CSF細(xì)胞蠟塊ICC染色26例MC患者細(xì)胞蠟塊均制作成功，結(jié)合ICC染色的癌細(xì)胞檢出率：癌細(xì)胞EMA、CK(+)，CD14、GFAP(-)。其中15例(57.70%)CKL(+)、CKH(-)，診斷為轉(zhuǎn)移性腺癌；7例(26.92%)CKH(+)、CKL(-)，診斷為轉(zhuǎn)移性鱗癌，4例(15.38%)CKH、CKL均(+)，診斷為腺鱗癌(圖2)。

3 討論

MC既往又稱癌性腦膜炎，是指惡性腫瘤彌漫性或多灶性腦膜(包括硬腦膜、蛛網(wǎng)膜及軟膜)和脊膜播散或浸潤，腫瘤侵犯腦膜后可能通過若干途徑進(jìn)入CSF，包括經(jīng)腦膜小血管直接轉(zhuǎn)移到CSF，先侵犯硬腦膜后再逐漸生長進(jìn)入CSF，自腦表面的轉(zhuǎn)移病灶上脫落到CSF，以及沿神經(jīng)根生長進(jìn)入CSF等，而顱內(nèi)并無占位性實(shí)質(zhì)病變，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移瘤的一種特殊類型，屬于癌癥患者晚期階段嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥。WHO(2018)全球癌癥報(bào)告顯示MC發(fā)病率逐年增高。肺癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，20%～65%的肺癌患者在病程中會(huì)發(fā)生腦轉(zhuǎn)移，是腦轉(zhuǎn)移性腫瘤中最常見的類型，預(yù)后差，平均生存時(shí)間僅1～2個(gè)月[5]。

近年盡管國外有多種MC診斷方法，如CSF流式細(xì)胞儀法、CSF體外細(xì)胞循環(huán)法[6]、18F-FDG PET/CT[7]等，但其最終確診均依賴于CSF細(xì)胞學(xué)，該方法敏感性為75%～90%，特異性為100%，重復(fù)3次送檢檢出率>90%。但臨床上諸多MC患者由于疾病進(jìn)展迅速，顱內(nèi)壓增高明顯，無法多次進(jìn)行腰部穿刺檢查，限制其臨床應(yīng)用。

體液細(xì)胞學(xué)蠟塊技術(shù)已在胸腹腔積液[8]、子宮頸液基細(xì)胞等中進(jìn)行探討和應(yīng)用，目前尚未在CSF細(xì)胞學(xué)中進(jìn)行探索。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與傳統(tǒng)CSF細(xì)胞病理學(xué)技術(shù)相比，CSF 細(xì)胞蠟塊技術(shù)的制備程序較為簡單，可重復(fù)性好，腫瘤細(xì)胞檢出率較高，易于ICC染色和識(shí)別；此外避免了多次腰部穿刺，便于長期存儲(chǔ)，且能夠被臨床多次應(yīng)用，有助于MC患者進(jìn)一步診斷及評(píng)估。與腹腔液、子宮頸液等體液相比，CSF蛋白含量較低，需要外源血漿蛋白等輔以沉淀制塊。

普通CSF細(xì)胞制作過程中吸取的少量且制作完畢后剩余的CSF樣本往往被遺棄，而細(xì)胞蠟塊可以收集送檢CSF中的絕大部分細(xì)胞，以便觀察大部分細(xì)胞的形態(tài)，且細(xì)胞蠟塊易于保存。本實(shí)驗(yàn)均是利用普通CSF細(xì)胞制作后剩余的CSF進(jìn)行蠟塊制作。CSF細(xì)胞沉淀物制作成的細(xì)胞蠟塊，起到聚集細(xì)胞的作用，相當(dāng)于組織塊，可長期保存，能夠連續(xù)切片，其切片較薄，鏡下觀察細(xì)胞HE染色結(jié)構(gòu)清晰，核質(zhì)分明，顏色鮮艷。如診斷需要可部分行ICC染色，記錄診斷結(jié)果并分析，便于進(jìn)一步行其他特殊染色及原位基因檢測等。

因此，此項(xiàng)CSF細(xì)胞蠟塊制備技術(shù)操作簡單，耗材少，便于普及推廣，對(duì)特殊病因的診斷有一定的應(yīng)用價(jià)值。細(xì)胞蠟塊組與常規(guī)組診斷一致性好，表明細(xì)胞蠟塊技術(shù)能夠代替特殊CSF的檢查，CSF細(xì)胞蠟塊制備較好地為診斷提供新方法和途徑，可推薦為CSF細(xì)胞學(xué)診斷的另一種方法。