食管鱗狀細(xì)胞癌腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中podoplanin的表達(dá)及臨床意義

田 華，楊永國，梅 霞

食管癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，鱗狀細(xì)胞癌是食管癌最常見的組織學(xué)類型。研究表明，惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展不僅取決于腫瘤細(xì)胞本身，而且腫瘤內(nèi)的間質(zhì)微環(huán)境在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中也起著重要作用。podoplanin是淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物，因其在微淋巴管密度及淋巴管癌栓判斷中具有重要價值而廣泛用于外科病理診斷中。有研究發(fā)現(xiàn)，podoplanin不僅標(biāo)記淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，而且在食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中也有表達(dá)，但相關(guān)報道較少。本文應(yīng)用免疫組化EnVision法檢測150例ESCC中podoplanin的表達(dá)，著重探討podoplanin在ESCC腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)的相關(guān)性及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2016～2018年江蘇省江都人民醫(yī)院病理科150例ESCC手術(shù)切除標(biāo)本。所有病例術(shù)前均未行任何放、化療。150例ESCC中男性102例，女性48例，年齡51～80歲，平均68歲。腫瘤最大直徑<4 cm者97例，≥4 cm者53例。腫瘤分化程度：高分化9例、中分化107例、低分化34例。腫瘤浸潤深度：T1期26例、T2期44例、T3期80例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者60例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者90例；有脈管侵犯者44例，無脈管侵犯者106例；神經(jīng)侵犯者35例，無神經(jīng)侵犯者115例；pTNM分期根據(jù)AJCC第8版分期：Ⅰ期37例，Ⅱ期55例，Ⅲ期57例，Ⅳ期1例。

1.2 免疫組化所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋。免疫組化采用EnVision法，具體操作步驟根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。抗原修復(fù)采用高壓鍋高溫、高壓抗原修復(fù)，抗原修復(fù)液為枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0)。一抗podoplanin鼠抗人單克隆抗體(D2-40，即用型)，購自北京中杉金橋公司。采用腫瘤組織內(nèi)的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞作為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3 結(jié)果判斷podoplanin在間質(zhì)梭形細(xì)胞中呈胞質(zhì)陽性，當(dāng)podoplanin在間質(zhì)梭形細(xì)胞中陽性率>10%時判定為陽性。podoplanin在腫瘤細(xì)胞中陽性定位于細(xì)胞質(zhì)伴/不伴胞膜陽性，當(dāng)陽性率≥5%判定為陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中podoplanin表達(dá)與ESCC臨床病理特征的關(guān)系采用χ2檢驗，腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中podoplanin表達(dá)的相關(guān)性采用Spearmann相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 ESCC間質(zhì)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中podoplanin表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系podoplanin在ESCC間質(zhì)細(xì)胞中陽性定位于細(xì)胞質(zhì)，腫瘤細(xì)胞中陽性定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，而且主要位于癌巢周圍的腫瘤細(xì)胞中(圖1、2)。間質(zhì)細(xì)胞中podoplanin表達(dá)隨腫瘤浸潤深度增加而陽性率也增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和脈管侵犯ESCC的間質(zhì)細(xì)胞中podoplanin表達(dá)明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和脈管侵犯者(P<0.05)；pTNM分期Ⅲ+Ⅳ期ESCC的間質(zhì)細(xì)胞中podoplanin表達(dá)明顯高于Ⅰ+Ⅱ期(P<0.01)；而間質(zhì)細(xì)胞中podoplanin表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤大小、分化程度和神經(jīng)侵犯均無關(guān)(P>0.05)。podoplanin在ESCC腫瘤細(xì)胞中的陽性率為33.3%(50/150)，podoplanin在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管侵犯和Ⅲ+Ⅳ期ESCC腫瘤細(xì)胞中表達(dá)明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無脈管侵犯和Ⅰ+Ⅱ期ESCC，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而腫瘤細(xì)胞中podoplanin表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、浸潤深度以及神經(jīng)侵犯均無關(guān)(P>0.05，表1)。

圖1 ESCC間質(zhì)細(xì)胞中 podoplanin的表達(dá)，EnVision法
圖2 ESCC腫瘤細(xì)胞中 podoplanin的表達(dá)，EnVision法

表1 ESCC間質(zhì)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中podoplanin表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.2 ESCC間質(zhì)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中podoplanin共表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系150例ESCC中，podoplanin在間質(zhì)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞共陽性者44例，陽性率為29.3%(圖3)。間質(zhì)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中podoplanin共表達(dá)與ESCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管侵犯、神經(jīng)侵犯和pTNM分期密切相關(guān)(P<0.05)；與患者性別、年齡、腫瘤大小、分化程度和浸潤深度均無關(guān)(P>0.05，表2)。

圖3 ESCC腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中 podoplanin的表達(dá)，EnVision法

表2 ESCC間質(zhì)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中podoplanin共陽性與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 ESCC間質(zhì)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中podoplanin表達(dá)的相關(guān)性50例腫瘤細(xì)胞podoplanin陽性患者中，間質(zhì)細(xì)胞podoplanin陽性者44例；100例腫瘤細(xì)胞podoplanin陰性患者中，間質(zhì)細(xì)胞podoplanin陽性者37例。經(jīng)Spearmann相關(guān)分析，兩者呈正相關(guān)(P<0.01，表3)。

表3 ESCC腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中podoplanin表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

近年越來越多的研究表明，除了腫瘤細(xì)胞被作為治療干預(yù)的主要靶點外，腫瘤周圍的微環(huán)境以及腫瘤-間質(zhì)細(xì)胞相互作用在腫瘤進(jìn)展中也起著至關(guān)重要的作用[1]。podoplanin屬于Ⅰ型跨膜黏液樣糖蛋白，最初因發(fā)現(xiàn)其在小鼠腎小球足細(xì)胞表達(dá)而命名。隨后研究發(fā)現(xiàn)其可見于各種正常組織包括淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞、骨骼肌、胎盤等[2]。目前在外科病理診斷中主要是用于鑒別淋巴管和血管、診斷間皮瘤和睪丸生殖細(xì)胞腫瘤等標(biāo)志物[3-4]。最近文獻(xiàn)報道podoplanin也可表達(dá)于各種惡性腫瘤細(xì)胞包括食管癌、頭頸部癌、乳腺癌以及癌相關(guān)性纖維母細(xì)胞中，其發(fā)揮不同的生物學(xué)意義[5-6]。

目前，podoplanin在食管癌中的表達(dá)已有一些文獻(xiàn)報道。Chuang等[7]報道59例ESCC中podoplanin的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ESCC中podoplanin高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，但未能發(fā)現(xiàn)與ESCC患者生存期低有關(guān)。Chao等[8]分析113例新輔助放、化療后ESCC中podoplanin的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞podoplanin高表達(dá)與淋巴血管侵犯呈正相關(guān)，多因素分析顯示腫瘤細(xì)胞podoplanin表達(dá)是獨立的預(yù)后因素。Tong等[9]也發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞中podoplanin高表達(dá)與ESCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且podoplanin高表達(dá)ESCC患者的5年無瘤生存率明顯低于podoplanin中～低表達(dá)ESCC患者。上述結(jié)果顯示ESCC腫瘤細(xì)胞中podoplanin表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度和TNM分期有關(guān)，提示腫瘤細(xì)胞podoplanin表達(dá)水平可預(yù)測ESCC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和進(jìn)展，可促進(jìn)ESCC的侵襲性生長。本實驗分析150例ESCC中podoplanin表達(dá)，結(jié)果顯示腫瘤細(xì)胞podoplanin表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管侵犯和pTNM分期呈正相關(guān)，也進(jìn)一步證實腫瘤細(xì)胞中podoplanin表達(dá)可使ESCC癌細(xì)胞具有高度的侵襲、轉(zhuǎn)移能力。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化是惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制。Wicki等[10]研究發(fā)現(xiàn)podoplanin僅在腫瘤浸潤前沿與正常間質(zhì)接觸的癌細(xì)胞中表達(dá)，且這些腫瘤細(xì)胞也同時呈E-cadherin細(xì)胞膜陽性，表明podoplanin并不是通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移和浸潤周圍組織。Suzuki-Inoue等[11]研究發(fā)現(xiàn)podoplanin是表達(dá)于血小板表面的信號受體CLEC-2的內(nèi)源性配體，當(dāng)podoplanin與CLEC-2結(jié)合后能誘導(dǎo)血小板聚集，而血小板圍繞腫瘤細(xì)胞聚集可以保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受剪切力和NK細(xì)胞的損害，促使血流內(nèi)腫瘤細(xì)胞巢形成，同時活化的血小板也釋放生長因子，刺激血管形成或腫瘤生長。

雖然癌癥研究主要集中于腫瘤細(xì)胞，但最近研究顯示腫瘤間質(zhì)對癌癥發(fā)生以及腫瘤細(xì)胞具有重要影響。腫瘤間質(zhì)主要由癌相關(guān)性纖維母細(xì)胞組成，其基因和功能上不同于間質(zhì)普通的纖維母細(xì)胞。梁曉東等[12]研究證實ESCC中podoplanin陽性間質(zhì)細(xì)胞同時也表達(dá)α-SMA，提示癌相關(guān)性纖維母細(xì)胞具有肌纖維母細(xì)胞特征，結(jié)果顯示ESCC間質(zhì)細(xì)胞中podoplanin表達(dá)與淋巴管侵犯有關(guān)，與患者性別、年齡、腫瘤大小、浸潤深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期均無關(guān)。Hoshino等[13]應(yīng)用體外實驗研究顯示，與人肺組織來源的纖維母細(xì)胞和肺腺癌細(xì)胞系共同注射相比，podoplanin陽性的人血管外膜纖維母細(xì)胞和肺腺癌細(xì)胞系共同注射可導(dǎo)致更高比例的腫瘤形成，進(jìn)一步對112例肺腺癌標(biāo)本中podoplanin表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)podoplanin陽性的癌相關(guān)性纖維母細(xì)胞有較高的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率和復(fù)發(fā)風(fēng)險。最近Hu等[6]對4 883例實體腫瘤進(jìn)行Meta分析，結(jié)果顯示podoplanin陽性的癌相關(guān)性纖維母細(xì)胞明顯降低實體腫瘤類型的總生存期和無瘤生存期，且podoplanin陽性的癌相關(guān)性纖維母細(xì)胞數(shù)量越多，腫瘤越具有不良的臨床病理學(xué)特征如淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM高分期、淋巴管和血管侵犯等。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)間質(zhì)細(xì)胞中podoplanin表達(dá)隨著腫瘤浸潤深度增加而增加，伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和脈管侵犯的ESCC中間質(zhì)細(xì)胞podoplanin表達(dá)明顯高于不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和脈管侵犯者；pTNM分期Ⅲ+Ⅳ期ESCC間質(zhì)細(xì)胞中podoplanin表達(dá)明顯高于Ⅰ+Ⅱ期。本實驗結(jié)果進(jìn)一步證實了ESCC中podoplanin陽性間質(zhì)細(xì)胞可促進(jìn)食管癌的發(fā)展。

目前podoplanin在食管癌中雖然已有一些研究，但其主要集中于腫瘤細(xì)胞或間質(zhì)細(xì)胞中，且研究的病例數(shù)量較少。本實驗不僅分析podoplanin在腫瘤細(xì)胞或間質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)，而且分析了其在腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中共表達(dá)的臨床病理學(xué)意義，國內(nèi)外文獻(xiàn)尚未見相關(guān)報道。本實驗發(fā)現(xiàn)podoplanin在腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞共陽性者44例，且腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中podoplanin共陽性與ESCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管侵犯、神經(jīng)侵犯和pTNM呈正相關(guān)，提示ESCC腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中podoplanin表達(dá)相互作用對食管癌的生物學(xué)行為具有明顯影響。本實驗相關(guān)分析顯示，腫瘤細(xì)胞podoplanin和間質(zhì)細(xì)胞podoplanin表達(dá)呈正相關(guān)，進(jìn)一步提示腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)癌相關(guān)性纖維母細(xì)胞之間的相互作用對腫瘤微環(huán)境具有明顯影響。有研究發(fā)現(xiàn)口腔鱗狀細(xì)胞癌中腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的IL-1β可刺激纖維母細(xì)胞分泌TGF-β1，后者可誘導(dǎo)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的podoplanin表達(dá)，導(dǎo)致癌癥進(jìn)展，同時鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞分泌的IL-1β也具有自分泌效應(yīng)，可刺激鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞分泌TNFα，TNFα可以作為旁分泌信號促進(jìn)癌相關(guān)性纖維母細(xì)胞活化，增強癌細(xì)胞的侵襲[14-15]。

總之，本組發(fā)現(xiàn)ESCC腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中podoplanin表達(dá)可以促進(jìn)ESCC的侵襲性生長，且腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞共表達(dá)podoplanin，提示腫瘤和間質(zhì)可以協(xié)同作用增強ESCC的侵襲、轉(zhuǎn)移能力。因此，檢測ESCC中podoplanin表達(dá)可有助于評估ESCC的生物學(xué)行為，從而更好地指導(dǎo)臨床治療。