胰腺腫瘤大切片技術(shù)

丁桂齡，蔣 慧，劉艷芳，鄭建明

胰腺癌是一種侵襲性強、惡性程度高、轉(zhuǎn)移早、預后差且病死率高的惡性腫瘤，由于其起病隱匿且癥狀不典型，患者確診時多已處于晚期階段[1]。因此，胰腺腫瘤的精確診斷和全面評估對于臨床治療至關(guān)重要。病理大切片技術(shù)在胰腺腫瘤中的應(yīng)用罕有報道，不僅因為掌握這項技術(shù)的單位較少，還因為胰腺腫瘤本身手術(shù)難度系數(shù)大、毗鄰結(jié)構(gòu)復雜且胰周脂肪組織較多導致制片困難等。傳統(tǒng)胰腺手術(shù)切除標本因受包埋盒容積的限制，取材塊數(shù)多且切片小，不但破壞了腫瘤的完整性、毗鄰關(guān)系、切緣情況等，還給后續(xù)病理技師制片和病理醫(yī)師閱片帶來繁重的工作。本實驗中胰腺腫瘤大切片能夠最大程度地保留標本組織結(jié)構(gòu)的完整性，為病理醫(yī)師更準確和全面地觀察腫瘤全貌并進行綜合性評估提供便利，也為臨床治療提供參考，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料選取海軍軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院存檔的胰腺腫瘤手術(shù)切除標本100例。標本脫水盒(大小7.5 cm×5.2 cm×1.5 cm)；不銹鋼包埋底座(大小8.5 cm×6.0 cm×2.5 cm)；載玻片(大小7.5 cm×5.2 cm×0.1 cm)，蓋玻片(大小6.6 cm×5.2 cm)。Leica ASP300S脫水機，Leica 2235常規(guī)輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機和Leica大號定制不銹鋼夾頭，羽毛牌一次性切片刀，優(yōu)質(zhì)切片石蠟(皓天工藝蠟公司)。

1.2 方法

1.2.1標記切緣和固定 胰腺手術(shù)切除標本離體30 min內(nèi)立即送往病理科，用不溶于水、乙醇、二甲苯等溶液的染料涂抹標本各切緣，待染料凝固后置于足量的10%中性福爾馬林中固定24～48 h。

1.2.2取材和裝盒 固定良好的胰腺切除標本按解剖結(jié)構(gòu)擺放于取材臺(圖1)：胰十二指腸切除標本采用冠狀面或橫斷面取材，胰體尾切除標本采用與主胰管平行的平面取材。組織大小與選取的脫水盒大小相匹配，取材標本厚度常為4～5 mm(圖1)，過薄易致切片組織脫落，過厚易致組織脫水不充分。標本切面向下置于脫水盒中，依次編號并拍照，避免標本混淆。可適度選用大頭針或有孔平板輕壓組織固定，避免組織卷曲、變形從而影響切片質(zhì)量。

1.2.3脫水 整個過程均在全封閉自動組織脫水機中進行，脫水機試劑溫度設(shè)定為45 ℃，脫水機壓力設(shè)定為常壓，石蠟溫度設(shè)定為65 ℃，具體步驟：(1)85%乙醇1.5 h；(2)95%乙醇Ⅰ 1.5 h；(3)95%乙醇Ⅱ 2 h；(4)無水乙醇Ⅰ 1 h；(5)無水乙醇Ⅱ 2 h；(6)無水乙醇Ⅲ 2 h；(7)二甲苯2 h×2次；(8)浸蠟2 h×3次。

1.2.4包埋 先向不銹鋼包埋底座內(nèi)注入1/2已溶解的石蠟，夾取組織放入蠟槽內(nèi)，用鑷子調(diào)整并輕壓組織，確保組織不卷曲、變形且組織全部處在同一水平面上，而后放置并壓緊包埋盒，最后再次注滿已溶解的石蠟，待冷卻后將蠟塊和包埋盒與底座分離(圖2)。

圖1 胰腺黏液性非囊腺癌大體取材圖 圖2 包埋盒已注滿溶解的石蠟，待冷卻后將蠟塊與不銹鋼底座分離

1.2.5切片 使用Leica 2235常規(guī)輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機進行切片，夾頭換成大號定制的Leica不銹鋼夾頭(圖3)，Leica展片水槽溫度調(diào)為39 ℃，Leica烤片臺溫度調(diào)制為75 ℃，切片前蠟塊已置于冰箱或者冷動臺降溫。切片機刻度調(diào)制為4 μm，先用廢舊羽毛牌一次性切片刀進行粗修片致暴露組織最大切面，而后進行精細連續(xù)切片。切片有兩面，反光面朝下緊貼切片刀，另一面向上。攤片時應(yīng)用小彎鑷子把組織蠟片的反光面朝下(否則切片易產(chǎn)生皺褶和氣泡)，輕輕放入Leica展片水槽中。如組織蠟片有皺褶，用小彎鑷子的彎部把皺褶打開；如組織蠟片有氣泡，將小彎鑷子伸入水中，用鑷子尖部把蠟片下的氣泡趕走。待組織完全展開后用大小7 cm×5 cm的載玻片進行撈片。傾斜貼好蠟片的載玻片，待水自然流下，用紗布擦拭完蠟片周圍的水分，置于烤片臺烤片。

1.2.6染色 常規(guī)HE染色流程。

2 結(jié)果

2.1 蠟塊質(zhì)量采用專用脫水程序進行脫水處理后，蠟塊平整無裂痕，硬度適中(圖4)，易于切出4 μm厚的完整、無斷裂的切片。

圖3 制作胰腺癌大切片的Leica 2235切片機和Leica大號定制不銹鋼夾頭 圖4 采用專用脫水程序進行脫水處理后，胰腺腫瘤蠟塊平整無裂痕，硬度適中，待切片

2.2 制片質(zhì)量在光鏡下觀察大切片，可更直觀完整地觀察組織全貌(圖5)，判斷腫瘤所處的具體位置、腫瘤大小和范圍以及毗鄰結(jié)構(gòu)，也能發(fā)現(xiàn)小癌灶、多癌灶和癌周組織病變情況以及標本切緣情況。染色核質(zhì)對比鮮明，無明顯收縮現(xiàn)象(圖6)。

3 討論

Leica 2235常規(guī)輪轉(zhuǎn)式切片機在夾頭更換的條件下，既可進行常規(guī)病理切片又可進行病理大切片，這為裝置設(shè)備不高端的病理科開展大切片技術(shù)提供了可能。廢舊刀片的合理利用，既節(jié)約了成本又提高了制片質(zhì)量。本科室通過實踐總結(jié)的胰腺切除標本大切片脫水時間(20 h)小于文獻報道的時間(38 h)[2]，脫水效果亦良好，制片容易，染色效果良好，既保證了脫水質(zhì)量又提高了工作效率。

傳統(tǒng)胰腺腫瘤切除標本的取材和制片，不但破壞了腫瘤的完整性，還不利于病理技師制片和病理醫(yī)師在顯微鏡下對腫瘤進行綜合性評估。胰腺腫瘤大切片技術(shù)較常規(guī)組織切片技術(shù)有以下不同之處：(1)病理醫(yī)師組織取材切面較大但組織取材塊數(shù)相對較少；(2)組織固定、脫水和切片制作周期較長，制片技術(shù)難度系數(shù)提高，但切片質(zhì)量有保證，病理診斷結(jié)果更精準；(3)病理技師制片工作量減少；病理醫(yī)師能更全面、完整、無拼接地觀察整個切除組織的全貌，能更直觀地觀察病變范圍、腫瘤組織與正常組織的演變關(guān)系，能增加發(fā)現(xiàn)微小殘留癌灶的可能性，能客觀真實地對病變進行全面直觀地觀察和綜合性評估；(4)在實際科研工作中，該技術(shù)還可與影像圖像進行對比，提高對疾病整體全面的認識；在對所有蠟塊進行制片的基礎(chǔ)上還可以利用相關(guān)技術(shù)對腫瘤組織進行三維重建等。

圖5 胰腺黏液性非囊腺癌鏡下HE全貌 圖6 胰腺黏液性非囊腺癌：細胞質(zhì)富含黏液，間質(zhì)大量黏液分泌，核質(zhì)對比鮮明，無明顯收縮現(xiàn)象

本文總結(jié)的胰腺腫瘤大切片技術(shù)，在無特殊高端設(shè)備的前提下，可以在一張切片上無拼接地顯示腫瘤整體結(jié)構(gòu)、腫瘤分布情況、腫瘤范圍及與周圍正常組織的關(guān)系，更好地為精確病理診斷和臨床治療提供幫助，從而更好地服務(wù)于醫(yī)療、教學和科研工作。理論上，按照此方法的其它組織大切片制作也可以進行。該技術(shù)在基層病理科也可以開展，值得推廣應(yīng)用。