免疫組織化學(xué)染色中不同返藍(lán)液效果評(píng)價(jià)

王曉星，易慕華，方捷迪，李爭(zhēng)艷，曹春雨

免疫組化是通過抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，利用帶顯色劑標(biāo)記的特異性抗體(或抗原)對(duì)組織細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的抗原(或抗體)進(jìn)行定性、定位、定量檢測(cè)的一項(xiàng)技術(shù)[1-2]，是病理科最常用的確診疾病和診斷疑難病例的一種輔助檢測(cè)手段[3-4]。免疫組化操作步驟包括抗原修復(fù)、抗體孵育、DAB顯色、蘇木精復(fù)染、分化、返藍(lán)等[5-7]，每一步都會(huì)影響切片的評(píng)片等級(jí)(如優(yōu)秀、良好、合格及不合格)，良好及以上的評(píng)片標(biāo)準(zhǔn)中不僅要求抗原定位準(zhǔn)確、陽(yáng)性著色與背景對(duì)比顯著，還要求蘇木精復(fù)染適度。我科參加湖北省病理科醫(yī)療質(zhì)量控制中心舉辦的全省免疫組化室間測(cè)評(píng)活動(dòng)成績(jī)合格，專家組發(fā)現(xiàn)本科的免疫組化雖染色強(qiáng)度不錯(cuò)，但復(fù)染效果差。我科針對(duì)這一問題，及時(shí)邀請(qǐng)專家現(xiàn)場(chǎng)指導(dǎo)，蘇木精染色在酸性條件下呈棕色，在堿性條件下呈藍(lán)色，蘇木精過染深分化后的返藍(lán)尤為重要，同時(shí)將堿性抗原修復(fù)液EDTA用于細(xì)胞核返藍(lán)，可重復(fù)性高，適用范圍廣，故迫切將EDTA的新用途向病理同仁進(jìn)行匯報(bào)。本實(shí)驗(yàn)將病理科常用的幾種返藍(lán)液用于細(xì)胞核的藍(lán)化，了解不同返藍(lán)液的返藍(lán)效果，重點(diǎn)評(píng)價(jià)非常規(guī)使用的EDTA作為返藍(lán)液對(duì)陰性細(xì)胞核返藍(lán)后的顏色和穩(wěn)定性，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料隨機(jī)選取三峽大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院2017年1～12月存檔的石蠟標(biāo)本20例，復(fù)習(xí)完整的臨床資料，所有患者術(shù)前均未行放、化療等其他治療，標(biāo)本前期處理一致，均經(jīng)規(guī)范化取材、10%中性福爾馬林固定、常規(guī)組織脫水、透明、浸蠟、包埋及制片。每個(gè)標(biāo)本按免疫組化染色要求連續(xù)切6張切片，分為6組，每組20張(即20例)。

1.2 儀器與試劑隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(HENGZI，上海躍進(jìn)公司)。即用型鼠抗人Ki-67核抗原單克隆抗體(Catalog#0077)購(gòu)自DAKO公司，顯色系統(tǒng)購(gòu)自DAKO公司。碳酸鋰粉末(BASO公司)、濃氨水(西隴化工公司)及EDTA液體試劑(DAKO公司)經(jīng)購(gòu)買后在實(shí)驗(yàn)室或科內(nèi)按要求自行配制。飽和碳酸鋰溶液：碳酸鋰粉末溶解于1 000 mL蒸餾水中，pH約9.0；0.3%氨水：將3 mL濃氨水溶解于1 000 mL蒸餾水中，pH約9.0；EDTA溶液：將EDTA原液用蒸餾水稀釋50倍待用，室溫下EDTA溶液pH約8.0，50 ℃時(shí)pH約8.5。

1.3 方法免疫組化染色采用EnVision兩步法：3 μm厚連續(xù)切片，依次將石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，EDTA(pH 9.0)對(duì)組織抗原進(jìn)行高壓修復(fù)，3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，滴加一抗Ki-67，37 ℃孵育60 min；取出切片，滴加二抗，37 ℃孵育30 min；DAB顯色10 min，蘇木精復(fù)染6 min、分化20 s、返藍(lán)2 min、脫水、透明和封固。返藍(lán)試劑分別為飽和碳酸鋰(pH 9.0)、0.3%氨水(pH 9.0)、室溫EDTA(pH 8.0)、加熱EDTA(pH 8.5)、流動(dòng)自來水(pH 7.0)及溫水(pH 7.2)，以上返藍(lán)試劑室溫為(15±2) ℃，加熱溫度為(50±2) ℃。

1.4 結(jié)果判定Ki-67陽(yáng)性信號(hào)位于細(xì)胞核，優(yōu)質(zhì)的免疫組化切片標(biāo)準(zhǔn)是復(fù)染適宜，染色清晰，著色恰當(dāng)，陰性與陽(yáng)性部位藍(lán)棕相映，對(duì)比分明，透明度高。

2 結(jié)果

基于組織前處理及免疫組化染色方法相對(duì)一致前提下，蘇木精復(fù)染后最佳返藍(lán)液是以得到最適陰性細(xì)胞核藍(lán)染及最佳陽(yáng)性和陰性棕藍(lán)對(duì)比為標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)分別選取飽和碳酸鋰、0.3%氨水、加熱EDTA(約50 ℃)、室溫EDTA、溫水、流動(dòng)自來水共6種溶液作為返藍(lán)液，同批次染色分別作用于標(biāo)本來源相同的免疫組化切片，即該實(shí)驗(yàn)僅返藍(lán)液不同，其它條件完全相同，本實(shí)驗(yàn)中20例切片在不同返藍(lán)液作用下均可返藍(lán)，現(xiàn)以其中1例乳腺癌標(biāo)本進(jìn)行詳細(xì)闡述。

免疫組化切片返藍(lán)效果顯示6種返藍(lán)液均具有返藍(lán)作用，但返藍(lán)結(jié)果不一致，其中流動(dòng)自來水(圖1A)處理后，胞核呈藍(lán)黑色，組織切片對(duì)比度及透明度均差，間接影響免疫組化的結(jié)果判讀；而經(jīng)加熱EDTA(約50 ℃)返藍(lán)后(圖1B)切片復(fù)染適合，著色適度，透明度好，陰性部位與陽(yáng)性部位藍(lán)棕相映，對(duì)比鮮明，但部分區(qū)域陰性核較灰暗；切片經(jīng)室溫EDTA(圖1C)或溫水(圖1D)處理后，陰性細(xì)胞核顯藍(lán)紫色；而飽和碳酸鋰(圖1E)及0.3%氨水(圖1F)返藍(lán)后，細(xì)胞核呈紫色。結(jié)果表明，加熱EDTA(約50 ℃)、室溫EDTA與其它四種返藍(lán)液效果相仿，作為抗原修復(fù)液的EDTA獲得新的應(yīng)用，可考慮作為返藍(lán)液。

圖1 使用不同返藍(lán)液返藍(lán)顯示乳腺癌中Ki-67的表達(dá)，EnVision兩步法：A.流動(dòng)自來水(pH 7.0)；B.加熱EDTA(約50 ℃，pH 8.5)；C.室溫EDTA(pH 8.0)；D.溫水(pH 7.2)；E.飽和碳酸鋰(pH 9.0)；F.0.3%氨水(pH 9.0)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過查閱資料并結(jié)合國(guó)內(nèi)病理科技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀，選擇病理科普遍使用的6種返藍(lán)液，即飽和碳酸鋰[8]、0.3%氨水[9]、EDTA(室溫)、EDTA(50 ℃)、流動(dòng)自來水及溫水(50 ℃)，以上試劑具有經(jīng)濟(jì)實(shí)惠、方便實(shí)用、使用廣泛和高效性。以湖北省為例，流動(dòng)自來水不同縣市的水質(zhì)及pH存在顯著差異，當(dāng)該地區(qū)流動(dòng)自來水質(zhì)偏酸性則會(huì)使細(xì)胞核經(jīng)蘇木精復(fù)染再返藍(lán)后細(xì)胞核偏紅或棕，返藍(lán)效果不佳，直接影響免疫組化切片的染色效果與切片優(yōu)良率，為達(dá)到優(yōu)良評(píng)價(jià)等級(jí)，技術(shù)員常通過調(diào)節(jié)流動(dòng)自來水的溫度或沖洗時(shí)間來達(dá)到最佳返藍(lán)效果，但有時(shí)會(huì)出現(xiàn)制片時(shí)間過長(zhǎng)或因不同技術(shù)員間出現(xiàn)個(gè)體差異。本實(shí)驗(yàn)以其中1例乳腺癌標(biāo)本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示6種返藍(lán)試劑均具有返藍(lán)作用，加熱EDTA(約50 ℃)或室溫EDTA與飽和碳酸鋰、0.3%氨水、流動(dòng)自來水及溫水(50 ℃)效果相當(dāng)，可考慮將抗原修復(fù)液EDTA用作返藍(lán)液。

EDTA可作為返藍(lán)液的原因：(1)EDTA是堿性試劑，EDTA的返藍(lán)原理和其他返藍(lán)液一樣，均是使蘇木精復(fù)染后的細(xì)胞核在堿性條件下呈現(xiàn)藍(lán)色。(2)溶液溫度對(duì)pH存在一定的影響，通常溫度升高，溶液電解質(zhì)電離越強(qiáng)，電離出更多的氫氧根離子，溶液的pH升高。實(shí)驗(yàn)中室溫EDTA的pH約8.0，加熱EDTA的pH 8.5，流動(dòng)自來水pH 7.0，溫水pH 7.2，加熱后的返藍(lán)液pH變大，這一結(jié)果與溫度的改變引起溶液pH改變理論相一致。(3)與其它pH不同的返藍(lán)試劑相比，pH為8.0～8.5的環(huán)境下也適合細(xì)胞核的藍(lán)化。(4)作為組織修復(fù)的EDTA試劑中含有脫蠟劑，增加切片的透明度，促使細(xì)胞核的藍(lán)色更鮮艷。所以，EDTA不僅可用于免疫組化中的組織抗原修復(fù)，還可以再加熱作為后續(xù)的返藍(lán)試劑用于臨床及科研中對(duì)細(xì)胞核的藍(lán)化，保證返藍(lán)液的新鮮與酸堿度，在節(jié)約成本的同時(shí)，使免疫組化切片染色達(dá)到免疫組化室間質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，但其返藍(lán)的缺陷暫未發(fā)現(xiàn)。