全自動免疫組化儀在標準化染色質量控制中的應用體會

陳晶晶，張 婭，李敏敏，李傳應

免疫組化技術不僅用于病理輔助診斷，還用于腫瘤靶向治療的靶點檢測和預后評估，其正確的檢測結果關系到患者的治療方向，進而標準化管理和質量控制是重中之重[1]。影響免疫組化染色的因素很多，其中包括環(huán)境條件、組織處理、抗體質量、染色流程等。傳統(tǒng)的手工操作步驟多、時間長，操作過程中難免會產(chǎn)生人為的實驗誤差和染色質量問題，影響染色結果的準確性與穩(wěn)定性，甚至誤導病理診斷醫(yī)師[2]。為進一步改善免疫組化染色結果的一致性、重復性和可靠性，我科室自2012年開始使用全自動免疫組化染色儀，經(jīng)過不斷摸索取得良好效果，現(xiàn)將經(jīng)驗體會總結如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑全自動免疫組化儀、電腦(內置軟件)。即用型一抗(選擇免疫組化抗體CD10和TdT)、 DAB染色液和增強型DAB染色液試劑盒、封蓋膜、脫蠟清洗緩沖液、細胞前處理液(EDTA，pH 8.0～8.5)和清洗緩沖液(Reaction Buffer)。

1.2 標本選取骨髓T淋巴母細胞性淋巴瘤10例、腎透明細胞癌10例，使用全自動免疫組化儀和兩種不同的染色方法進行染色對比，選擇的標本內附正常組織，作為內對照。

1.3 方法標本經(jīng)10%中性福爾馬林固定、處理、石蠟包埋，2～3 μm厚切片，60 ℃干燥箱烤片過夜。全自動免疫組化儀染色基本流程：脫蠟、抗原修復、一抗(可選擇半開放和全封閉)、二抗、DAB顯色，蘇木精復染，人工脫水透明封固。

2 結果

免疫組化染色結果背景干凈、定位準確、強度適中、復染清晰。CD10陽性定位于細胞膜/質，腎透明細胞癌中CD10呈胞膜/胞質強陽性，內對照基膜陽性。兩種染色方法對比，Multimer多聚體法呈弱陽性(圖1)，Hapten Multimer多聚體法呈強陽性(圖2)。TdT陽性定位于細胞核，骨髓T淋巴母細胞淋巴瘤組織中TdT呈細胞核強陽性。兩種染色方法對比，Multimer多聚體法呈弱陽性(圖3)，Hapten Multimer多聚體法呈強陽性(圖4)。

圖1 CD10在腎透明細胞癌的胞膜/胞質中呈弱陽性，Multimer多聚體法 圖2 CD10在腎透明細胞癌的胞膜/胞質中強陽性，Hapten Multimer多聚體法 圖3 TdT在骨髓T淋巴母細胞淋巴瘤的細胞核中弱陽性，Multimer多聚體法 圖4 TdT在骨髓T淋巴母細胞淋巴瘤的細胞核中強陽性，Hapten Multimer多聚體法

3 討論

3.1 應用體會

3.1.1組織的選擇 10%中性福爾馬林及時、足量、充分固定的組織；在良好固定的基礎上，按標準規(guī)范原則處理的組織；對于使用酸性脫鈣液的標本不建議放在基于液體封蓋膜(LCS)技術的全自動免疫組化染色儀上操作；免疫組化標本盡量選擇含有正常組織成分的蠟塊。

3.1.2組織的切片 根據(jù)不同的組織結構，決定切片厚度2～4 μm不等，如淋巴組織細胞成分多樣，核型大小不等，細胞質欠豐富，如果厚度大于3 μm容易出現(xiàn)細胞堆積現(xiàn)象，雖然抗原表達豐富，但鏡下細胞不宜區(qū)分類型和計數(shù)，易造成定位假象；再比如腎上腺和肝臟腫瘤細胞成分單一，細胞透亮，胞質豐富甚至透明，厚度最好控制在3～4 μm，鏡下腫瘤細胞抗原表達達到該有的強度，更易區(qū)分正常與非正常細胞。

3.1.3切片的質量 在組織切片過程中，避免褶皺、刀痕、折疊以及氣泡，出現(xiàn)非特異性染色現(xiàn)象；烤片溫度控制在63～65 ℃烤片2 h或60 ℃烤片過夜，合理控制溫度，過高會出現(xiàn)組織裂紋影響判讀，同時也會影響抗原的保存[3]；上機玻片選擇帶正電荷防脫片，因為玻片電荷的分布不均會導致油膜下沉，影響抗原和抗體的結合，從而出現(xiàn)不顯色或染色不均等情況，檢測前建議利用5%～10%脫脂牛奶浸泡白片10 min，改善玻片親水性，避免產(chǎn)生假陰性[4]。

3.1.4對照的選擇 每張待測組織切片上貼附已知陽性對照組織，有時由于組織處理不同等人為方面的因素，導致外部條件產(chǎn)生差異，影響結果的觀察，還會造成成本、人力、物力的極大浪費。為解決這一難題，本實驗室采取多組織春卷蠟塊作為陽性對照，同時盡量選擇帶有正常組織的待測標本，作為內對照。在判讀過程中，以觀察外設陽性對照為主，合理使用內對照，這樣可以增加染色結果的可信度，使結果更具有可靠性、直觀性、穩(wěn)定性[5]。

3.1.5上機前的準備 檢測項目條碼標簽打印清晰，平整貼在玻片上，避免標簽下氣泡，以防儀器運行中出現(xiàn)油膜下氣泡，造成油膜下沉，影響抗體的孵育和染色效果；另外試劑管液面和彈簧的檢查，抗體種類和劑量是否符合上機切片的要求、試劑瓶彈簧是否正常使用、試劑瓶乳頭是否有氣泡和結晶，以上均會影響抗體能否足量、準確的加注；操作結束后，請及時清洗，補足緩沖液，及時檢查廢液桶清空和管道通暢情況，在檢查確認儀器各環(huán)節(jié)無誤后，再運行染色程序。

3.1.6染色程序運行細節(jié) 在運行染色程序時，由于受各種因素影響，通常會有報警現(xiàn)象發(fā)生，對于各種報警應及時給予有效處理。正確讀取區(qū)別報錯信息，是否機器自身原因還是操作原因，及時與專業(yè)技術人員溝通。在同一次染色過程中，全自動免疫組化儀無法同時運行兩種一抗滴加方式，只能運行手工滴加或自動滴加，選擇一抗手工滴定加程序應及時根據(jù)提示進行滴加，在實施滴加操作前應對組織切片進行檢查，觀察其是否存在油膜下沉、切片移位等情況，并及時給予補救，如果選擇自動滴加，盡量選擇與全自動免疫組化儀相匹配的原裝進口試劑；另外盡量降低放置機器操作間的室內溫度，保持抗體效價的穩(wěn)定性。

3.1.7抗體檢測程序細節(jié) 在應用全自動免疫組化儀檢測的過程中，“Protocol”的條件制定極為重要，通過預實驗，選擇出適合每種抗體的理想“Protocol”。通常情況下，以目標抗體正常表達譜和無非特異性背景染色為準。檢測過程中，由于修復過度或不正確修復都會導致非特異染色，從而出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象；另外，還應注意各種廠家抗體出廠稀釋度的不同，影響染色表達強度，從而出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象；孵育時間或修復時間延長，并不一定可以提高抗體的陽性率，應盡量避免選用高溫孵育或超長修復[6]。全自動免疫組化儀操作中，還會出現(xiàn)即用型不同廠家的一抗在同一“Protocol”的條件下，染色結果差異明顯甚至完全不同，這個不難理解，可能是因為開放性一抗，不同廠家均以手工實驗濃度作為預實驗濃度，再使用到全自動免疫組化儀中，因操作原理不同，抗體的出廠濃度再次被稀釋，同一抗體不同廠家使用同一個“Protocol”，可能影響免疫組化染色質量，無法達到標準化。

3.1.8儀器維護相關細節(jié) 為保障檢測的效果，日常工作結束后，及時按照清洗程序對其進行清洗；追蹤儀器報錯信息，及時聯(lián)系專業(yè)工程師進行專業(yè)維護與保養(yǎng)，并且做好記錄工作。日常保養(yǎng)中，可以將500 mL稀釋消毒滅菌液倒入試劑瓶內，將其充分搖勻，使其附著于容器表面并靜置幾分鐘后，適用蒸餾水將其徹底洗凈；切片托盤的清洗應使用消毒滅菌溶液擦洗，讓滅菌液在電熱板表面停留約10 min后專業(yè)毛刷清洗；將一定量的濃縮消毒滅菌液放入空桶中，對廢液桶進行清洗消毒滅菌。

3.2 切片染色效果的技術評價首先鏡下觀察對照表達情況，染色結果背景干凈、定位準確、強度適中、復染清晰；然后評價待測目的組織與內對照表達情況是否符合；最后填寫免疫組化染色質控記錄表。

3.3 相關問題討論我科自使用全自動免疫組化儀以來，不論選擇封閉流程還是開放流程，出現(xiàn)了一些需要技術員思考的問題，比如陽性外對照和組織內對照哪個更有說服力？不同廠家的全自動免疫組化儀怎么選擇搭配抗體，是否真能達到標準化？誰能準確的判斷和分析切片染色的質量？通過實驗總結如下：(1)通過觀察CD10在腎透明細胞癌組織中的表達情況，陽性外對照和組織內對照相互結合評估染色效果更為可靠。(2)對于使用酸性脫鈣液的骨髓活檢標本免疫組化染色，通過選擇不同染色平臺的全自動免疫組化儀、機器搭配的原裝試劑或濃縮型抗體和調試最優(yōu)“Protocol”和最佳稀釋度，染色結果能夠達到該有的強度。(3)免疫組化室質控技術員對每批免疫組化切片染色質量進行技術評估，并與診斷醫(yī)師建立良性溝通，積極聽取反饋意見，動態(tài)觀察并記錄總結。

全自動免疫組化儀能夠極大地提高工作效率，減少手工操作誤差，提升染色流程的穩(wěn)定性，在應用過程中，應做好各細節(jié)準備工作，專人加強質量管理，從而有效提高全自動免疫組化儀的制片質量，充分發(fā)揮其應用價值。