3D軟骨細胞微球行冷凍切片及染色的方法介紹

陳 菲，李 麗，包春娟

3D軟骨細胞微球采用三維培養間充質干細胞誘導軟骨細胞成球，是組織工程研究的常用技術手段[1]。由于培養周期較長，需借助病理技術手段監測球體細胞生長情況。通常軟骨細胞微球直徑<1 mm，行石蠟包埋的樣本雖便于保存，但細胞球易出現皺縮、形態改變、樣本丟失。本科室采用前固定樣本行冷凍切片并染色觀察軟骨細胞微球狀態取得良好效果，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料間充質干細胞誘導的兔軟骨細胞微球20例，巴氏滴管，吸水紙，冷凍組織OCT包埋劑(Thermo NEG50)，一次性刀片(Thermo MX35 ULTRA)，蘇木精(Thermo Hematoxylin 7211)，伊紅(Thermo 7111)，甲苯胺藍染色試劑盒(Solarbio G3661)，丙酮，Collagen II抗體(Thermo，#MS-235-PO)，胃蛋白酶(福州邁新，#DIG-3009)，羊血清(北京中杉金橋，#ZLI-9021)，驢血清(ImmunoReagents、#SP-072-VX2)，兔/鼠通用型免疫組化檢測試劑盒(Dako K5007)，冷凍切片機(Thermo NX70)，自動蓋片機(Thermo Clearvue)，顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1冷凍切片 離心管內培養間充質干細胞誘導的兔軟骨細胞3周，微球肉眼可見(圖1)，吸除培養基，經4%多聚甲醛固定24 h，15%、30%蔗糖水脫水18、24 h。準備兩種不同顏色的冷凍組織OCT包埋劑，先用一種在冷凍托盤打底，厚度約0.5 cm，待凝固后切平，齊夾頭頂端用記號筆做好標記。用巴氏滴管吸取離心管內軟骨細胞球，平鋪在制備好的樣本托上，用吸水紙迅速吸干多余蔗糖溶液，加適量第二種顏色的包埋劑(圖2)，速凍后沿標記方向放置、制片。切片厚5 μm，貼于黏附載玻片上備用。

1.2.2HE、甲苯胺藍及免疫組化染色 (1)常規HE染色：將切片放入DDH2O清洗3次，放入蘇木精染液中3 min，1%鹽酸乙醇分化，流水返藍，伊紅染色30 s，依次經80%、95%、100%Ⅰ、100%Ⅱ乙醇脫水及分色，二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明，Clearvue自動蓋片機封片。(2)甲苯胺藍染色：將清洗后的切片平鋪于濕盒，滴加200 μL 甲苯胺藍染液，使其完全覆蓋，染色30 min用DDH2O洗凈多余染液，甩干水分用丙酮分化至軟骨細胞呈藍色，無水乙醇脫水，二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明，Clearvue自動蓋片機封片。(3)免疫組化EnVision兩步法染色：將清洗后的切片滴加200 μL胃蛋白酶，37 ℃孵育15 min，PBS清洗后滴加過氧化物酶阻斷劑(3%H2O2)于組織上，避光孵育15 min，清洗后甩掉組織周圍的液體(組織切勿干燥)，滴加10%羊血清與10%驢血清等體積混合液200 μL，室溫封閉20 min，滴加200 μL一抗Collagen II 工作液于組織上，4 ℃冰箱孵育過夜后PBS清洗3 min×3次，滴加200 μL兔/鼠通用型免疫組化檢測試劑盒中的二抗(ChemMate EnVision+HRP)于組織上，37 ℃孵育45 min；清洗后滴加顯色劑DAB工作液200 μL，光鏡下控制顯色；蘇木精復染，乙醇脫水、二甲苯透明、Clearvue自動蓋片機封片。

圖1 離心管內培養間充質干細胞誘導的兔軟骨細胞3周，微球肉眼可見 圖2 先用一種顏色OCT打底后切平，放軟骨細胞微球后加另一種顏色OCT，呈平行記號筆方向涂抹，將樣本包裹

圖3 HE染色核質分明，軟骨細胞形態完整 圖4 甲苯胺藍染色軟骨細胞呈紫紅色且分布均勻 圖5 Collagen II呈棕黃色纖維狀分布，細胞核藍染，EnVision法

2 結果

軟骨細胞微球結構完整，位于軟骨陷窩內，體積較小呈卵圓形，單個分布。HE染色核質分明，軟骨細胞形態完整(圖3)；甲苯胺藍染色軟骨細胞呈紫紅色且分布均勻(圖4)；免疫組化標記Collagen II呈棕黃色纖維狀分布，細胞核藍染(圖5)。

3 討論

傳統的細胞培養模式是在細胞孔板或爬片上培養單層細胞，在長期的單層培養中，軟骨細胞會由橢圓形或多邊形轉變為梭形的成纖維細胞，由表達Collagen II變為Collagen I的成纖維細胞特異性基質，失去軟骨細胞特性[2]。在三維培養體系中，軟骨細胞在立體環境中有充足的空間持續增殖，大量累積蛋白聚糖形成類似軟骨囊樣結構[1]，重現組織內環境，以研究組織工程中信號傳導、基因表達、藥物反應等相互間作用。隨著科研水平的深入發展，由干細胞產生的3D微型組織，廣泛的被學者用于體外研究，迄今為止，類器官培養已用于腦、肝臟、乳腺[3-5]等組織，被評為《Nature》雜志的年度技術，因此從細胞微球到微型組織借助病理技術手段進行鑒定已成為發展趨勢。

如何獲得真實良好的病理結果，總結如下：(1)4%多聚甲醛固定后，經梯度蔗糖脫水(30%蔗糖脫水時間可適當延長至48 h)，待組織下沉后再行冷凍切片，避免細胞微球內水分多形成冰晶，影響制片效果。(2)冷凍組織包埋環節至關重要，由于組織過小避免切過，冷凍組織包埋劑OCT建議選用兩種顏色，先使用一種顏色打底后切平，并用記號筆做好方向標記后取下；吸取細胞微球后，務必將多余蔗糖溶液快速吸除，避免溶液在冷凍過程形成冰塊；涂抹第二種顏色冷凍組織包埋OCT時，應平行記號筆方向涂抹，用量應小于第一種OCT。(3)冷凍切片時應遵循慢進原則，由于組織透明不易觀察，當粗修到第二種OCT剩余少量且第一種OCT將暴露時，應緩慢細修，可借助顯微鏡鏡檢確保樣本切片效果；建議均使用黏附載玻片，防止樣本在處理過程中丟失。(4)冷凍組織包埋劑OCT是聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物[6]，染色前至少清洗3次以上，待膠印洗脫后再進行染色處理。(5)由于軟骨細胞具有合成和分泌基質與纖維的功能，因此選用Collagen II進行免疫組化標記。本實驗中選用胃蛋白酶消化，若采用其它抗體檢測，可使用熱修復方法，但時間不宜過長，防止脫片。(6)本實驗免疫組化均采用10%羊血清與10%驢血清等體積混合液封閉，可有效提高特異性染色并降低非特異染色背景。除以上常用檢測外，均可進行其他染色或免疫學檢測。目前本科室已順利完成60余例樣本實驗，取得良好效果，建議推廣使用。