PTEN與CyclinG1蛋白在嬰幼兒血管瘤組織中的表達及意義

余咸靜 鄭騰飛

[摘要]目的：探究血管瘤組織第10號染色體丟失的磷酸酶及張力蛋白同源物（PTEN）與細胞周期素G1（Cyclin G1）的表達。方法：回顧性分析142例血管瘤患兒臨床資料，比較血管瘤瘤體組織與瘤旁組織、增殖期與消退期血管瘤組織、術后6個月內復發與未復發血管瘤組織PTEN、Cyclin G1蛋白表達情況，以受試者工作特征（ROC）曲線評估上述指標對血管瘤復發的預測效能，通過Pearson相關系數模型分析上述指標與血管瘤表面積、深度、微血管密度（MVD）的相關性。結果：PTEN蛋白表達情況比較顯示，血管瘤瘤體組織明顯低于瘤旁組織，增殖期血管瘤組織明顯低于消退期血管瘤組織，預后復發血管瘤組織明顯低于預后未復發血管瘤組織（P<0.05）;Cyclin G1蛋白表達情況比較顯示，血管瘤瘤體組織明顯高于瘤旁組織，增殖期血管瘤組織明顯高于消退期血管瘤組織，預后復發血管瘤組織明顯高于預后未復發血管瘤組織（P<0.05）。且PTEN、Cyclin G1蛋白表達水平聯合預測復發的靈敏度與特異度可達64.10%、78.64%。血管瘤組織PTEN蛋白表達與病灶表面積、深度、MVD均呈顯著負相關性（r<0，P<0.05），Cyclin G1蛋白表達與病灶表面積、深度、MVD均呈顯著正相關性（r>0，P<0.05）。結論：血管瘤組織存在PTEN蛋白低表達與Cyclin G1蛋白過表達情況，且表達水平與病情、預后均聯系緊密，可為疾病發生、發展的機制研究及臨床預后評估提供指導。

[關鍵詞]第10號染色體丟失的磷酸酶及張力蛋白同源物;細胞周期素G1;血管瘤組織;蛋白表達;相關性

Abstract： Objective? To explore the significance of phosphatase and tension homology deleted on chromosome ten （PTEN） and cyclin G1 （Cyclin G1） in hemangioma tissues. Methods? The clinical data of 142 children patients with hemangiomas were retrospectively analyzed. The protein expressions of PTEN and Cyclin G1 were compared between hemangioma tissues and para-tumor tissues， between proliferative and regressive hemangioma tissues and between recurrent and non-recurrent hemangiomas within 6 months after surgery. The receiver operating characteristic （ROC） curve was used to evaluate the predictive efficacy of the above indexes on recurrence of hemangiomas. The correlation between the above indexes and the surface area， depth and microvessel density （MVD） of hemangiomas was analyzed by Pearson correlation coefficient model. Results? The expression of PTEN protein in hemangioma tissues was significantly lower than that in para-tumor tissues， and the expression in proliferative hemangioma tissues was significantly lower than that in regressive hemangioma tissues， and the expression in tissues with prognosis of recurrent hemangioma was significantly lower than that in tissues with prognosis of non-recurrence （P<0.05）. The expression of Cyclin G1 protein in hemangioma tissues was significantly higher than that in para-tumor tissues， and the expression in proliferative hemangioma tissues was significantly higher than that in regressive hemangioma tissues， and the? expression in tissues with prognosis of recurrent hemangioma was significantly higher than that in tissues with prognosis of non-recurrence （P<0.05）. The sensitivity and specificity of combined detection of PTEN and Cyclin G1 proteins were 64.10% and 78.64% in predicting recurrence. The PTEN protein expression in hemangioma tissues was significantly negatively correlated with surface area， depth and MVD of lesions （r<0， P<0.05）， and the Cyclin G1 protein expression was significantly positively correlated with surface area， depth and MVD of lesions （r>0， P<0.05）. Conclusion? There is a low expression of PTEN protein and overexpression of Cyclin G1 protein in hemangioma tissues， and the expression levels are closely related to the disease condition and prognosis. They can provide guidance for the mechanism study of disease occurrence and development and the evaluation of clinical prognosis.

Key words： phosphatase and tension homology deleted on chromosome ten（PTEN）; Cyclin G1; hemangioma tissues; protein expression; correlation

血管瘤是內皮細胞與周細胞異常增殖引起的常見良性腫瘤，嬰幼兒較為常見，發病率可達4%～5%[1]，由于病灶位置淺表，可觀察到紅色丘疹、結節或斑塊等癥狀，嚴重影響患兒外觀，不利于其心身健康發育[2]。血管瘤具體發病機制目前尚未獲得共識，可能與女性、早產、低出生體重、多胎妊娠、高齡產婦及父母毒性物質接觸等因素有關[3]，盡管部分患兒能在數月后自行消退，但臨床仍推薦開展早期治療，以確保良好療效與外觀恢復[4]。近年來，腫瘤生物學行為分析已成為研究熱點，第10號染色體丟失的磷酸酶及張力蛋白同源物（PTEN）屬于典型的抑癌基因表達蛋白，已證實能抑制肝癌細胞增殖[5];細胞周期素G1（Cyclin G1）則是典型的細胞周期負調控蛋白，能提高肝癌細胞放射線敏感度[6]。猜測血管瘤細胞編碼PTEN也可能具有阻礙腫瘤浸潤作用，對細胞周期異常激進狀態可造成一定負面影響，導致Cyclin G1表達受到反饋抑制，猜想兩者聯合檢測可對血管瘤生物學行為進行早期評估，從而對患兒病情作出及早判斷，可為臨床診療與病理基礎研究提供一定參考。基于此，本研究旨在分析血管瘤組織表達PTEN、Cyclin G1蛋白與其疾病特征的關系，取得一定成果，現作如下報道。

1? 資料和方法

1.1 臨床資料：回顧性分析2017年1月-2018年12月，于筆者醫院接受治療的142例血管瘤患兒臨床資料。納入標準：①臨床表現與組織學病理檢查結果均符合血管瘤相關診斷標準[7];②月齡≤24個月;③家長同意采集標本用作研究。排除標準：①術前已接受任何抗腫瘤措施;②身體條件無法耐受手術;③術中未能獲得完整腫瘤病理組織與瘤旁組織。其中男32例，女110例;月齡為1～24個月，平均（11.57±8.26）個月;病灶位于頜面部74例，肩頸部29例，胸背部20例，腹部7例，四肢12例;病灶表面積為（11.83±3.64）cm2;病灶深度為（10.51±3.07）mm;病程為（9.74±3.25）個月;增殖期腫瘤79例，消退期腫瘤63例;術后隨訪6個月內復發39例（術后6個月內瘤體增大≥20%，或顏色加深程度≥20%可確診為血管瘤復發），未復發103例。

1.2 檢測方法：組織采集后置于4%多聚甲醛固定24h，常規石蠟包埋，切片厚度4μm，72℃烘箱烤片1h，依次浸入二甲苯、無水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇5～15min不等，進行脫蠟與水化處理;蒸餾水浸泡5min×3次，磷酸鹽緩沖液（PBS）浸泡5min×1次，以pH=6.0檸檬酸鹽抗原修復液高壓鍋內處理3min，自然冷卻2h至室溫;PBS浸泡5min×3次，滴加3%過氧化氫滅活內源性過氧化物酶，37℃下孵育30min;PBS浸泡5min×3次，滴加羊血清工作液封閉，37℃下孵育30 min;傾去血清不予洗滌，分別向不同標本加入兔抗人PTEN單克隆抗體（美國Cell Signaling Technology有限公司提供）、兔抗人Cyclin G1單克隆抗體（上海優寧維生物科技有限公司提供），向空白對照標本滴加等體積PBS，4℃下孵育過夜;PBS浸泡5min×3次，滴加生物素化二抗，37℃下孵育30min;PBS浸泡5min×3次，滴加辣根過氧化物酶標記鏈霉素卵白素工作液，37℃下孵育30min;PBS浸泡5min×3次，加入二氨基聯苯胺（DAB）顯色，低倍鏡下觀察組織顯色情況后迅速以自來水沖洗5min終止反應;滴加蘇木素染色液進行核染色1min，1%鹽酸酒精分化液處理5s×3次，自來水沖洗5min反藍;依次浸入75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、無水乙醇1～5min不等，進行脫水處理，并以中性樹膠固封，晾干并置于高倍鏡下觀察;隨機選取5個視野，圖像采集后拷貝至Image-Pro Plus 6.0圖像處理軟件，分別測算PTEN、Cyclin G1蛋白陽性產物積分光密度（IOD）值。

1.3 統計學分析：研究數據均錄入統計學軟件SPSS 20.0進行處理，計數資料以例數表示，計量資料以均數±標準差（x?±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，不同組織之間比較采用配對t檢驗;將各指標同時納入二元Logistic回歸模型作為協變量，采用前進法，以返回概率作為聯合預測指標;預后預測效能評估采用受試者工作特征（ROC）曲線，獲取曲線下面積（95%CI）、靈敏度、特異度、截斷值等統計參數;相關性分析采用Pearson相關系數模型，雙側檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2? 結果

2.1 瘤體組織與瘤旁組織蛋白表達情況比較：瘤體組織PTEN蛋白陽性產物IOD值明顯低于瘤旁組織，Cyclin G1蛋白陽性產物IOD值明顯高于瘤旁組織，差異均有統計學意義（P<0.05），見表1、圖1～2。

2.2 增殖期與消退期血管瘤組織蛋白表達情況比較：增殖期血管瘤組織PTEN蛋白陽性產物IOD值明顯低于消退期血管瘤組織，Cyclin G1蛋白陽性產物IOD值明顯高于消退期血管瘤組織，差異均有統計學意義（P<0.05），見表2。

2.3 預后復發與未復發血管瘤組織蛋白表達情況比較：術后6個月內，預后復發患兒血管瘤組織PTEN蛋白陽性產物IOD值明顯低于未復發患兒血管瘤組織，Cyclin G1蛋白陽性產物IOD值明顯高于預后未復發患兒血管瘤組織，差異均有統計學意義（P<0.05），見表3。

2.4 預測效能評估結果：瘤體組織PTEN、Cyclin G1蛋白陽性產物IOD值預測血管瘤復發的截斷值分別為0.3816、0.3005，聯合預測靈敏度與特異度為64.10%、78.64%，見圖3、表4。

2.5 相關性分析結果：Pearson相關系數模型顯示，血管瘤組織PTEN蛋白表達與病灶表面積、深度、MVD均呈顯著負相關性（r<0，P<0.05），Cyclin G1蛋白表達與病灶表面積、深度、MVD均呈顯著正相關性（r>0，P<0.05），見表5。

3? 討論

PTEN基因定位于人10號染色體q23上，含有9個外顯子與8個內含子，可編碼出PTEN含有403個氨基酸，分子量為47kDa，蛋白N端有磷脂酰肌醇特異性結合域，是調控磷酸化酶的關鍵序列[8]。與其他抑癌基因蛋白不同，PTEN同時對脂質磷酸酶與蛋白磷酸酶具有雙重活性，對磷脂酰肌醇3-蛋白激酶（PI3K-Akt/PKB）通路可產生較強拮抗作用，促使細胞周期停止在G1期，并令蛋白激酶從胞質向胞膜上轉移，改變構象并向核內傳遞凋亡信號，導致細胞增殖停滯并走向凋亡[9-10]。本研究結果顯示，血管瘤組織PTEN蛋白表達顯著較瘤旁組織更低，增殖期血管瘤組織PTEN蛋白表達顯著較消退期血管瘤組織更低，預后復發患兒血管瘤組織PTEN蛋白表達顯著較預后未復發患兒血管瘤組織更低，且該指標與血管瘤表面積、深度、MVD均表現出明顯負相關性，這表明血管瘤組織與其他腫瘤相似，PTEN呈現出低表達狀態，增殖期瘤體內表達尤其活躍，可反映在病灶表面積、深度與MVD等浸潤性指標上，表達水平越低，浸潤行為越明顯，手術有更大風險遺留微小癌灶，預后則有更大幾率復發，因此可預測患兒預后情況，具有較高臨床檢測價值。相關專家表示，PTEN還能抑制腫瘤細胞中細胞外信號調節激酶-絲裂原活化蛋白激酶（ERK-MAPK）上游途徑接頭蛋白的磷酸化過程，進而產生負性調節，阻礙有絲分裂信號傳遞，并降低黏附斑激酶（FAK）的整合素活性，上調細胞黏附能力，抑制細胞骨架形成并阻礙其擴散，對腫瘤浸潤與轉移有較強攔截作用[11]。

Cyclin G最初發現于小鼠成纖維細胞中，含有Cyclin G1、Cyclin G2、Cyclin G3三種亞型，其中Cyclin G1基因定位于5號染色體q32-q34上，含有6個外顯子[12]。據相關文獻報道，泛素蛋白連接酶、Cyclin G1均是抑癌基因p53的轉錄激活靶點，可將細胞周期鎖定在G前期與G-S期，但由于反饋作用機制，野生型p53表達代償性上調的同時，泛素蛋白連接酶與Cyclin G1表達水平隨之增加，前者在細胞核內結合p53使其失活后失去生理病理效應，而Cyclin G1則呈現過表達狀態[13-14]。本研究發現，血管瘤組織Cyclin G1蛋白表達顯著較瘤旁組織更高，增殖期血管瘤組織Cyclin G1蛋白表達顯著較消退期更高，預后復發患兒血管瘤組織Cyclin G1蛋白表達顯著較預后未復發患兒血管瘤組織更高，且該指標與血管瘤表面積、深度、MVD均表現出明顯正相關性，提示血管瘤組織可發生Cyclin G1過表達狀態，表達量越高可反映腫瘤處于增殖期，由于抑制p53活性，細胞周期控制失效，腫瘤擴張更快，預后效果更差，但具體影響機制仍有待進一步基礎試驗研究確證。本研究還發現，PTEN聯合Cyclin G1蛋白聯合檢測，可較為準確預測血管瘤患兒預后復發情況，究其原因可能與兩種蛋白從不同路徑共同影響血管瘤細胞周期與生物學行為有關，因而聯合檢測對病理機制研究與預后判斷有重要意義。Li等[15]認為，Cyclin G1蛋白能借助與蛋白磷酸酶2A結合，促使泛素蛋白連接酶去磷酸化，從而加劇p53泛素化作用，腫瘤細胞失去負性調節而走向惡變，蛋白磷酸酶2A受到PTEN負性控制，因此同時檢測PTEN、Cyclin G1對早期辨識腫瘤惡變行為尤其關鍵。

血管瘤組織表達PTEN蛋白較為沉默，表達Cyclin G1蛋白較為活躍，尤其增殖期與預后復發病灶組織含量偏離明顯，兩者表達水平與腫瘤細胞周期運行、細胞增殖等行為均存在一定關系，免疫組織化學檢測可幫助臨床了解血管瘤發生、發展相關病理機制，并對患兒預后作出較為準確的預測，為早期預防性干預措施提供參考。

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