幾種水產常用抗生素對無乳鏈球菌的抑菌活性

陳福艷 覃雅 歐陽賢華 陳福彩 梁萬文 雷愛瑩 黎建斌

摘?要：為了篩選無乳鏈球菌敏感藥物，對9種常用漁藥抗生素進行了藥物敏感試驗，采用微量肉湯稀釋法進行測定，通過加入阿爾瑪藍指示劑和革蘭氏染色顯微鏡觀察，得出各抗菌藥物的最低抑菌濃度依次為：恩諾沙星0.3 μg/mL，氟苯尼考0.3 μg/mL，阿莫西林5.2 μg/mL，諾氟沙星0.9 μg/mL，強力霉素0.9 μg/mL，慶大霉素13.0 μg/mL，林可霉素17.6 μg/mL，新霉素22.0 μg/mL，磺胺嘧啶133.3 μg/mL。結果表明，恩諾沙星和氟苯尼考對無乳鏈球菌最敏感，殺菌力最強;在試驗過程中，阿爾瑪藍指示劑有助于抑菌結果的判斷。

關鍵詞：羅非魚;無乳鏈球菌;藥敏試驗

羅非魚（Oreochromis spp.）種類繁多，養殖較多的品種有吉富羅非魚 （Oreochromis niloticus）、奧尼羅非魚（Oreochromis niloticus×O. aureus）、紅羅非魚（Oreochromis mossambi-cus×O. niloticus）等品種[1]。羅非魚具有生長快，食性雜，無肌間刺，產量高等優點[2]，廣受養殖戶和消費者的喜愛。隨著生活水平的提高，人們更加注重健康生活和環境保護，要求“少污染，多健康和高效益”，因此對水產養殖工作者提出了更高的要求。水產養殖業大規模發展過程中，常受細菌疾病的侵害，其中由無乳鏈球菌引起的細菌病在每年的7-10月份爆發頻繁。兩廣地區羅非魚養殖場曾出現大批羅非魚發病、死亡，給羅非魚養殖業帶來了不可估量的經濟損失[3]。部分羅非魚感染鏈球菌后會出現魚眼球混白或者突出，體表發黑，肝、腎和脾等組織敗血等癥狀，嚴重影響羅非魚生長、存活率以及經濟效益[4]。

臨床上常規應對羅非魚細菌病防疫和治療措施主要是施加相應的抗生素，但近年來抗生素類藥物使用不規范，引起抗藥性和耐藥性等問題[5]，病害治療效果不佳，常發生持續性死亡，且難于根除;羅非魚患病后，飼料投喂量下降，影響魚的生長速度。因此對無乳鏈球菌病的防治工作迫在眉睫，有必要開展該菌的藥敏試驗，篩選出敏感的防治藥物，為臨床羅非魚鏈球菌病的防治提供參考。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?菌株來源?床菌株為本實驗室分離鑒定和保種的無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae，NO：180623）.

1.1.2?實驗藥物?試驗篩選了9種常用漁用抗生素：林可霉素、阿莫西林、磺胺嘧啶、慶大霉素、諾氟沙星（已禁用）、新霉素、恩諾沙星、氟苯尼考、強力霉素;這些藥物均為北京鑫洋水產科技有限公司贈送的原粉。

1.1.3?實驗儀器?電子天平、96孔培養板、移液器、恒溫搖床、50 mL離心管、酒精燈、分光光度計、恒溫培養箱、JA5003N電子天平、高壓蒸汽滅菌鍋、優普超純水器。

1.1.4?培養基?TSA培養基：胰蛋白胨 17 g，大豆胨 3 g，葡萄糖 2.5 g，NaCl 5 g，K2PO4 2.5 g，蒸餾水1 000 mL，pH值為7.0～7.2。

1.2?實驗方法

1.2.1?溶液配制?按參考文獻[6]的方法并根據預備實驗配制9種抗菌藥物的母液，他們依次為：林可霉素200 μg/mL、阿莫西林200 μg/mL、磺胺嘧啶450 μg/mL、慶大霉素100 μg/mL、新霉素50 μg/mL、諾氟沙星10 μg/mL、恩諾沙星2 μg/mL、氟苯尼考2 μg/mL、強力霉素2 μg/mL。用超純水配制母液濃度，完全溶解、攪拌均勻，用022 μm過濾器除雜除菌，置-20 ℃保存備用。

甘油20 mL，0.1%阿爾瑪藍（刃天青）溶液20 mL，配置完成后用0.22 μm過濾器過濾除菌，放置4 ℃冰箱保存。

配制TSA培養基1 L，121 ℃高壓滅菌，冷卻，放置4 ℃冰箱保存備用。

1.2.2?肉湯稀釋法

1.2.2.1?接種物的制備?將實驗菌株（NO：180623）活化后進行液體培養，接種完成后放到37 ℃搖床（100 r/min） 培養12 h，培養后的菌液進行稀釋，用分光光度計測量菌液濃度，將菌液濃度稀釋成1×105 cfu/mL，現配現用。

1.2.2.2?抗菌藥物濃度稀釋?參考預備實驗結果，確定最大濃度，將已滅菌的96孔培養板放置在超凈工作臺上進行無菌操作，按2/3倍數濃度梯度稀釋后，得出11個濃度梯度組。

1.2.2.3?菌液接種?在96微孔板上每一行的第1孔中加入相應稀釋一定濃度后的抗菌藥物300 μL，用8道移液槍吸取肉湯培養基100 μL加入第2～12孔，將第1孔藥液吹打均勻后吸取200 μL至第2孔，接著將第2孔藥液吹打均勻后吸取200 μL藥液至第3孔，以此類推直至第11孔時，吸除200 μL;第12孔作為空白對照，加入100 μL稀釋好的菌液（1×105 cfu/mL）。為了更好地觀察實驗結果，加入10 μL藍色阿爾瑪藍和10 μL甘油。每種藥物4個平行。加樣完成后，密封96微孔板，放置于37 ℃培養箱中培養12 h，連續觀察指示劑變化[7]。

1.2.2.4?結果判斷方法?結果判斷采用肉眼觀察與顯微觀察相結合。肉眼觀察即根據顏色變化和渾濁度來判斷是否生長細菌。當空白對照孔（第12孔）為紅色時，即為有效檢測，反之則無效，需重新實驗。以96微孔板上藍色的最低藥物濃度判斷為最低抑菌濃度（MIC），紅色孔判斷為不能殺死或抑制細菌生長濃度。顯微觀察即取各濃度組里的培養液進行革蘭氏染色與油鏡顯微觀察，以不生長細菌的最低藥物濃度為最低抑菌濃度（MIC）。

2?實驗結果

通過肉眼觀察實驗結果，即根據阿爾瑪藍指示劑在12 h的培養時間里顏色從青藍，到紅紫，最后粉紅的這個變化過程，判斷9種抗菌藥物對無乳鏈球菌的影響程度，得到各種藥物最小抑菌濃度為：恩諾沙星0.3 μg/mL，氟苯尼考0.3 μg/mL，阿莫西林5.3 μg/mL，諾氟沙星0.9 μg/mL，強力霉素0.9 μg/mL，慶大霉素13.0 μg/mL，林可霉素17.6 μg/mL，新霉素22.0 μg/mL，磺胺嘧啶133.3 μg/mL。

進一步驗證實驗結果，采用革蘭氏染色后油鏡顯微觀察，9種藥物的實驗結果與肉眼觀察結果一致?？梢妰煞N最小抑菌濃度判斷結果一致，阿爾瑪藍可作為藥敏結果判斷的指示劑。

3?討論

魯晶娣等[8]采用紙片藥敏試驗方法對來源于柳州不同地區的20株無乳鏈球菌進行藥敏試驗，結果表明不同來源菌株對同一種藥物敏感性存在差異。而本試驗只選用一株無乳鏈球菌進行藥敏試驗，盡管本實驗進行四組平行，該菌株的最低抑菌濃度可能與不同來源的無乳鏈球菌存在差異，因此本試驗結果僅供參考，具體用藥還需了解當地池塘的用藥史，盡量錯開用藥，同時嚴格遵守藥物使用規范。研究還表明20株無乳鏈球菌中對同種藥物敏感性有差異，結果如表2所示，這些抗菌類藥物敏感性分析可為養殖者提供參考。

梁志凌等[9]采用瓊脂擴散法的牛津杯法研究82種中草藥對無乳鏈球菌的抑菌活性。結果表明，其中抑菌能力最強的七種中草藥及其抑菌圈分別為：黃連（40 mm±2.1 mm） 、五倍子 （36 mm±1.9 mm）、紅藤（27 mm±0.9 mm） 、大蒜（27 mm±0.8 mm） 、北五味子（26 mm±1.1 mm） 、夏枯草（25 mm±1.6 mm） 、艾葉（25 mm±1.4 mm），這些結果為防治無乳鏈球菌篩選中草藥提供參考。

無乳鏈球菌在病害防治過程中，往往采用抗生素和中草藥配伍的防治方法，抗生素達到快速殺滅病菌，中草藥殺菌能力相對較弱但具有提高身體免疫力的作用，因此兩者相結合是當前常用的治療方法。但在抗生素與中草藥結合用藥時要注意藥物之間的協同作用與拮抗作用，具體有待進一步研究。

參考文獻：

[1]

王巧煌.福建紅羅非魚源無乳鏈球菌的分離鑒定及其分子特征[J].大連海洋大學學報，2019，34（1）：64-69.

[2] 壯林.廣西羅非魚鏈球菌的分離鑒定、藥敏試驗與病理學研究[D].南京農業大學，2012.

[3] 李旻，王凱，陳明，等.羅非魚無乳鏈球菌的分離純化及鑒定[J].大眾科技，2017，19（11）：85-89.

[4] 程世亮，劉新風，鄭文，等.魚類無乳鏈球菌病[J].動物醫學進展，2016，37（2）：105-109.

[5] 鄧顯文，謝芝勛，謝志勤，等.廣西羅非魚海豚鏈球菌的分離鑒定[J].廣西農業科學，2010，41（05） ： 495-498.

[6] 陳福艷，歐陽賢華，黃彩林，等.一種創傷弧菌快速藥敏試劑盒的研發[J].江西水產科技，2016（05）：10-14.

[7] 熊禮寬，周亞紅，付麗華，等.分枝桿菌藥物最低抑菌濃度的快速測定方法研究[J].動物醫學進展，2004，25（5）：78-81.

[8] 魯晶娣，韋盤秋，曾令杰，等.柳州地區羅非魚無乳鏈球菌與海豚鏈球菌分離株藥敏性分析[J].廣西畜牧獸醫，2019，35（2）：57-60.

[9] 梁志凌 ，馬艷平 ，馬江耀，等 .82種中草藥對羅非魚無乳鏈球菌的抑菌活性研究[J].廣東農業科學 ，2016，43（10）：128—133.

（收稿日期：2020-04-21）