低鈣高鎂人工腦脊液對大鼠腦片臂旁外側核神經元溫度敏感性的影響#

鄧杰文 胡紅利 楊培培 黃成 趙曦 全俊如 許莉 張錄順 張潔△

（1.成都醫學院基礎醫學院，四川 成都 610500；2.成都醫學院臨床醫學院，四川 成都 610500；3.成都醫學院檢驗醫學院，四川 成都 610500）

根據溫度敏感性是否依賴于突觸傳遞，體溫中樞視前區（Preoptic area，POA）的溫敏神經元分為固有溫敏神經元和條件溫敏神經元兩類。灌流低鈣高鎂人工腦脊液（Artificial cerebrospinal fluid，ACSF）阻斷POA神經元突觸傳遞后，大部分POA熱敏神經元保留了溫敏性，其溫敏機制源于內在離子電導的改變，與突觸傳遞沒有關系，屬于固有溫敏神經元；與之相反，阻斷突觸傳遞后，所有POA冷敏神經元失去了冷敏性，其溫度敏感性是突觸傳遞形成，屬于條件溫敏神經元[1-2]。

臂旁外側核（Lateral parabrachial nucleus，LPBN）能夠將經脊髓傳來的皮膚溫度信號直接上傳至POA區，參與了自主性和行為性體溫調節[3-5]。前期研究發現，大鼠LPBN參與前饋體溫調節的三個亞核（背亞核、中央亞核及外亞核）中均存在對局部腦溫變化敏感的熱敏神經元和冷敏神經元[6-8]，但其溫度敏感性是否依賴于突觸傳遞尚不清楚。因此，本研究通過應用腦片膜片鉗技術，灌流低鈣高鎂ACSF阻斷突觸傳遞，觀察LPBN神經元胞外自發放電活動及溫度敏感系數（m）值的變化，探討LPBN神經元溫度敏感性是否是內在固有特性，為后續進一步研究LPBN溫敏神經元的溫敏形成機制及其在溫度信息整合中的作用打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

健康雄性SD大鼠，體重80~150 g，購自成都達碩生物醫學科技有限公司。玻璃電極購自Sutter公司。HEPES、Na2GTP、葡萄糖酸鉀、EGTA、MgATP購自Sigma公司。ACSF成分（mmol?L-1）：NaCl 124，MgSO41.3，CaCl22.4，KCl 5，KH2PO41.24，NaHCO326，葡萄糖 10（滲透壓 300 mOsm?kgH2O-1，pH 7.4）。低鈣高鎂ACSF成分（mmol?L-1）：NaCl 119，MgSO411.4，CaCl20.2，KCl 5，KH2PO41.24，NaHCO326，葡萄糖 10（滲透壓 300 mOsm?kgH2O-1，pH 7.4）。電極內液成分（mmol?L-1）：葡萄糖酸鉀 130，Na2GTP 2，MgATP 2，HEPES 10，CaCl21，EGTA 10（滲透壓 290 mOsm?kgH2O-1，pH 7.2）。

1.2 LPBN大鼠腦薄片的制備

雄性SD大鼠以4%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，迅速斷頭取腦，制備含LPBN的腦干塊[6-8]。用502膠將腦干塊粘貼于振動切片機標本盤內進行振動切片。當一月牙形透明區出現在腦橋頭端背外側緣，表明已達LPBN吻端，開始切取腦片。通常可切取2至3片含LPBN的腦薄片（300 μm厚）。

1.3 腦片膜片鉗實驗

按參照文獻方法孵育腦片，并選取狀態良好的LPBN神經元進行實驗[6-8]。電極阻抗為4～7 MΩ，調整三維微推進器（MPC 200 Sutter Instruments,USA），使電極尖端與細胞膜表面接觸，適當給予負壓抽吸，形成細胞貼附式構型，然后轉換至電流鉗以記錄LPBN神經元的胞外自發放電，放電信號經放大器（EPC-10，HEKA，Germany）放大后，通過Patchmaster軟件進行信號采集，低通濾波為2 KHz，采樣頻率為10 KHz。

記錄36℃～37℃范圍內LPBN神經元基礎放電活動后，在32℃～40℃范圍內快速改變浴液溫度，檢測LPBN神經元自發放電頻率的變化[6-8]。將放電頻率和局部腦溫之間的線性回歸系數定義為溫度敏感系數m值（Impulses），根據m值來確定LPBN神經元溫度敏感性。m值≥0.8 imp·s-1·℃-1定義為熱敏神經元，m值絕對值≤0.2 imp·s-1·℃-1定義為低等斜率的溫度不敏感神經元，溫度敏感系數m值>0.2 imp?s-1·℃-1和m值＜0.8 imp?s-1·℃-1定義為中等斜率的溫度不敏感神經元[6-8]。鑒定神經元溫敏感性后，灌流低鈣高鎂ACSF10~15 min阻斷突觸傳遞，記錄LPBN神經元自發放電活動和m值的變化，最后灌流常規ACSF洗脫10~15 min。

1.4 統計學方法

Patchmaster記錄的原始數據經ABF Utility轉換后，用Clampfit分析，計算突觸阻斷后各指標相對于突觸阻斷前的變化率。數據以均數±標準差（±SD）表示，采用SPSS21.0統計軟件對數據進行配對樣本t檢驗，P<0.05表示有顯著性差異。

2 結果

2.1 低鈣高鎂ACSF對LPBN神經元自發放電活動的影響

表1顯示35個LPBN自發放電神經元突觸阻斷后放電活動和溫度敏感性的變化。灌流低鈣高鎂ACSF阻斷突觸傳遞后，熱敏神經元（n=13）和溫度不敏感神經元（n=22）的自發放電頻率變化均無統計學意義（P>0.05），但中等斜率和低等斜率溫度不敏感神經元放電頻率都呈現出多樣性改變，如中等斜率溫度不敏感神經元（n=11）的放電頻率7個加快，3個減慢，1個無變化；低等斜率溫度不敏感神經元（n=11）的放電頻率6個加快，3個減慢，2個無變化，見圖1A。灌流低鈣高鎂ACSF阻斷突觸傳遞后，對三類神經元的放電幅度均無顯著作用（P＞0.05），見表1，圖1B。

表1 突觸阻斷后不同類型LPBN神經元放電活動和溫度敏感性的變化（±SD）

表1 突觸阻斷后不同類型LPBN神經元放電活動和溫度敏感性的變化（±SD）

注：與突觸阻斷前比較，*P<0.05。

類別 例 放電頻率（imp?s-1） 放電幅度（mV） m值（imp?s-1·℃-1）阻斷前 阻斷后 阻斷前 阻斷后 阻斷前 阻斷后熱敏神經元 13 11.98±1.41 12.15±1.67 12.44±1.86 12.05±2.14 1.01±0.04 1.02±0.06溫度不敏感神經 12 8.27±0.98 9.98±1.57 16.96±2.19 17.12±2.75 0.18±0.03 0.42±0.09*

圖1 每個LPBN低等斜率、中等斜率溫度不敏感神經元和熱敏神經元突觸阻斷前后放電頻率（A）和放電幅度（B）的變化百分率

2.2 低鈣高鎂ACSF對LPBN神經元溫度敏感性的影響

灌流低鈣高鎂ACSF阻斷突觸傳遞后，熱敏神經元m值無明顯變化（P＞0.05），見表1、圖2。圖3所示是1例熱敏神經元，突觸阻斷前m值為 1.09 imp?s-1·℃-1，突觸阻斷后的m值為0.87 imp?s-1·℃-1，洗脫后的m值為0.94 imp?s-1·℃-1，始終保持熱敏性。突觸阻斷后溫度不敏感神經元的m值變化顯著（P<0.05），見表1。其中，64%（7/11）的中等斜率溫度不敏感神經元m值變化率在70%以上；82%（9/11）低等斜率溫度不敏感神經元的m值變化率在140%以上，見圖2。圖4所示低等斜率溫度不敏感神經元，突觸阻斷前的m值為0.05 imp?s-1·℃-1，突觸阻斷后的m值增加到1.14 imp?s-1·℃-1，變成熱敏神經元，洗脫后，其m值又恢復為0.05 imp?s-1·℃-1，失去熱敏性。在22例溫度不敏感神經元中，有4例出現相似的變化，突觸阻斷后，溫度敏感系數增加非常明顯，變成了熱敏神經元，洗脫后又恢復為溫度不敏感神經元，這4例溫度不敏感神經元的放電頻率明顯增加（P<0.01），突觸阻斷前后的放電頻率分別是11.85±5.72 imp?s-1和17.00±5.35 imp?s-1（n=4）。

圖2 每個LPBN低等斜率、中等斜率溫度不敏感神經元和熱敏神經元突觸阻斷前后m值的變化百分率

圖3 突觸阻斷前、后和洗脫后LPBN熱敏神經元自發放電頻率和溫度敏感性的變化

3 討論

LPBN能夠將經脊髓傳來的皮膚溫度信號直接上傳至POA區，引起前饋體溫調節反應，以維持體溫穩定[3-5]。采用腦片膜片鉗技術，我們在LPBN參與前饋體溫調節的三個亞核中都發現對局部腦溫變化敏感的熱敏和冷敏神經元[6-8]。在極端溫度下，當前饋體溫調節已不能維持體溫穩定，或在運動、攝入冷流體食物、出血等導致體溫的內穩態被破壞時，分布在POA、LPBN等核團的溫度敏感神經元可監測局部腦溫變化，以負反饋體溫調節的方式來維持體溫穩定[6]。

LPBN除了接受皮膚前饋溫度信號外，還能感受局部腦溫的變化。，但溫敏形成機制尚有待研究。在體溫中樞POA區，灌流低鈣高鎂ACSF阻斷突觸傳遞后，幾乎所有熱敏神經元保留了熱敏性；與之相反，突觸阻斷后，所有冷敏神經元失去了冷敏性，表明POA神經元熱敏性是其內在特性，冷敏性則是突觸傳遞形成[1-2]。本實驗采用相似的方法技術，分析LPBN神經元的溫度敏感性是否依賴于局部突觸網絡，為后續進一步探討其溫敏形成機制及其在溫度信息整合中的作用打下基礎。

圖4 突觸阻斷前、后和洗脫后LPBN溫度不敏感神經元自發放電頻率和溫度敏感性的變化

我們在LPBN離體腦片灌流低鈣高鎂ACSF 10~15 min阻斷突觸活動后發現， LPBN熱敏神經元在灌流低鈣高鎂ACSF后，放電頻率和幅度并無顯著改變，其溫度敏感性在突觸阻斷前、后和洗脫后，也無明顯的變化。說明和POA區相似，LPBN熱敏神經元的溫敏特性是其內在特性，而不是突觸傳遞形成，屬于固有溫敏神經元，其熱敏形成可能與其內在離子電導的溫度依賴性變化有關[1-2,9]。突觸阻斷后，熱敏神經元的放電頻率和溫度敏感性幾乎都沒有發生變化。提示，LPBN局部的許多突觸聯系并未投射到熱敏神經元，熱敏神經元很有可能更多接受的是LPBN以外的突觸聯系并在此發生信息整合，如脊髓傳來的皮膚溫度信息，孤束核傳來的內臟溫度信息，都有可能會聚到這些熱敏神經元并與局部溫度變化信息發生整合[3]。因此，LPBN極有可能與POA和脊髓相似，既能接受外周傳來的溫度信息，也能感受局部溫度變化，并將傳入的和局部的溫度信息整合后上傳到體溫中樞POA區，進一步引起體溫調節反應。

灌流低鈣高鎂ACSF后，LPBN溫度不敏感神經元的放電頻率呈多樣性改變，幅度無明顯變化，m值在突觸阻斷后大多增加。有4例溫度不敏感神經元在突觸阻斷后變成了熱敏神經元，洗脫后又恢復為溫度不敏感神經元。說明這類溫度不敏感神經元本身可能具有熱敏性，但其熱敏性被相鄰溫敏神經元的突觸活動所抑制。例如，與相鄰熱敏神經元形成抑制性突觸或與冷敏神經元形成興奮性突觸都可能導致其熱敏性被抑制。根據這些神經元突觸阻斷后放電頻率增加的現象，我們推測這些溫度不敏感神經元極有可能接受了相鄰熱敏神經元的抑制性突觸輸入，導致其熱敏性被抑制，呈現出溫度不敏感性。但這尚需通過觀察溫度變化對溫度不敏感神經元抑制性突觸活動的影響來進一步驗證。

LPBN功能復雜，除了參與體溫調節，還與代謝[10]、心血管[11]等活動的調節和痛、癢覺等信息的傳遞有關[12]。突觸阻斷后，LPBN溫度不敏感神經元的放電頻率呈多樣性改變。說明許多LPBN局部突觸聯系投射到溫度不敏感神經元，并形成了復雜的局部突觸網絡，這些溫度不敏感神經元雖然不能感受局部腦溫的變化，但可能參與了其他與體溫調節有關內穩態的調控，如代謝、心血管活動的調節，突觸阻斷后的多樣性反應，也可能與這些神經元參與多種功能調節有關。下一步需進一步研究其他內穩態系統反饋信號如葡萄糖、血壓對溫度敏感及不敏感的神經元活動的影響。

綜上所述，LPBN熱敏神經元屬于固有溫敏神經元，其溫敏特性不是突觸傳遞形成，而是其內在特性，可能與其內在離子電導的溫度依賴性變化有關。