99Tcm-MAG3-RRL腫瘤靶向肽的標(biāo)記和性質(zhì)鑒定

杜毓菁，閆 平，陳 釗，姜 巧，段小江，王榮福,2,*

1.北京大學(xué)第一醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，北京 100034；2.北京大學(xué)國(guó)際醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，北京 102206

多肽類(lèi)顯像劑的顯像應(yīng)用和化學(xué)開(kāi)發(fā)一直都是核醫(yī)學(xué)和核放射化學(xué)的研究重點(diǎn)[1-3]。一般來(lái)說(shuō)，小分子多肽具有易于人工合成、可控性高、分子量小、活性高、毒性低的優(yōu)點(diǎn)，故具有較好的臨床轉(zhuǎn)化前景，可被應(yīng)用于各種核素的標(biāo)記[4-5]。99Tcm可發(fā)射141 keV的純?chǔ)蒙渚€(xiàn)，同時(shí)化學(xué)價(jià)態(tài)多樣，從鉬锝發(fā)生器獲取較為便捷，所以是多肽核素標(biāo)記的常用核素。精氨酸-精氨酸-亮氨酸(Arg-Arg-Leu, RRL)是一種經(jīng)噬菌體文庫(kù)篩選并驗(yàn)證對(duì)腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞[5]和各種腫瘤細(xì)胞同時(shí)具有特異靶向性的寡肽序列[6-7]，其可被131I[8]、99Tcm [9]、68Ga[10]等核素標(biāo)記。原有RRL多肽的序列極難被99Tcm標(biāo)記，本課題組根據(jù)文獻(xiàn)[11]在其氨基末端添加甘氨酸-甘氨酸-(D)丙氨酸-甘氨酸(Gly-Gly-(D)Ala-Gly)四肽以進(jìn)行修飾，所形成天然穴狀結(jié)構(gòu)可螯合99Tcm。該法標(biāo)記率為70%～80%，放射化學(xué)純度在90%以上[12]。但是該直接標(biāo)記的方法難以滿(mǎn)足實(shí)際臨床轉(zhuǎn)化的標(biāo)準(zhǔn)，故本工作擬用雙功能螯合劑巰基乙酰基三甘氨酸(MAG3)連接多肽，探究其提高核素標(biāo)記率的可能并對(duì)其體外穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)估。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

SMA3000型紫外分光光度計(jì)，北京華大基因研究中心；RM905型放射性活度儀，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；FT-163 γ井型計(jì)數(shù)器，北京核儀器廠；BS110S電子天平，精度0.000 1 g，德國(guó)Startorius公司；pH測(cè)量計(jì)，意大利Hanna公司；電熱恒溫水浴鍋，上海醫(yī)療器械三廠；Tetras多肽合成儀，美國(guó)CreoSalus公司；Sep-pak C18固相萃取小柱，美國(guó)Waters公司。

MAG3-多肽，自行設(shè)計(jì)，委托北京中科亞光科技有限公司合成并純化，相對(duì)分子質(zhì)量為1 535.63，純度為98.94%；無(wú)水SnCl2，北京伊諾凱公司；Na99TcmO4溶液，北京原子高科股份有限公司；NaHCO3、丙酮、正辛醇、氨水(分析純)等，購(gòu)自北京化工廠；L-半胱氨酸(純度≥99.0%)，牛血清白蛋白粉末(純度97%)，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 MAG3-多肽的合成

RRL為核心功能區(qū)的十六肽氨基酸序列為Gly-(D-Ala)-Gly-Gly-Lys-(D-Ser)-(D-Ser)-Cys-Gly-Gly-Arg-Arg-Leu-Gly-Gly-Cys，其中Cys-Cys成環(huán)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將羥基琥珀酰亞胺酯(NHS)-MAG3偶聯(lián)在多肽Gly末端的氨基上，從而形成MAG3-多肽復(fù)合物。在北京中科亞光科技有限公司的協(xié)助下，采用下列技術(shù)路線(xiàn)：首先合成S-乙酰基巰基乙酰-N-羥基丁二酰亞胺(SATA)，即巰基乙酸和乙酸酐(摩爾比為1∶1.1)在室溫下反應(yīng)4 d，反應(yīng)產(chǎn)物以減壓蒸餾(115～125 ℃、267～400 Pa)純化，得到高純度的乙酰化巰基乙酸，然后將75 mmol乙酰化巰基乙酸與75 mmol NHS溶解于150 mL二氧雜環(huán)乙烷中，在4 ℃下與75 mmol二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)反應(yīng)16 h，過(guò)濾去除二環(huán)己脲，溶劑經(jīng)真空凍干后用異丙醇2次重結(jié)晶而得到SATA。然后采用自動(dòng)多肽合成儀常規(guī)固相法合成目標(biāo)多肽，并在合成過(guò)程中直接在其N(xiāo)端連接3個(gè)甘氨酸，且在最后一個(gè)氨基酸接完后去保護(hù)，加入SATA、二異丙基乙胺(3 mol/L DIEA)及1-羥基，苯并，三氯唑四甲基六氟磷酸鹽(HB-TU)、1-羥基苯并三唑(HOBT)反應(yīng)60 min，比例為1∶3∶7∶3∶3，茚三酮反應(yīng)檢測(cè)為黃色即可。然后用N-甲基吡咯烷酮、二氯甲烷交替洗6次抽干。把切割液(1 mL乙二硫醇、1 mL苯甲硫醚、68 mL三氟乙酸、0.5 g苯酚、0.4 mL H2O、0.1 mL三異丙基硅烷)倒入樹(shù)脂中，反應(yīng)3～4 h后抽濾，用乙醚沉淀、離心4次，最后晾干，純化得RRL-MAG3復(fù)合物，粗品到純品大概回收率是10%～20%。產(chǎn)物經(jīng)HPLC和質(zhì)譜鑒定，其中HPLC條件為：流動(dòng)相A液為0.05%(體積分?jǐn)?shù)，下同)三氟乙酸的2%乙腈，B液為0.05%三氟乙酸的90%乙腈，流速為1.0 mL/min，梯度為第1—20 min，B液從5%—25%。

1.3 99Tcm標(biāo)記

1.4 體外穩(wěn)定性的測(cè)定

取經(jīng)純化的99Tcm-MAG3-RRL各100 μL分別加入2倍體積的生理鹽水和50%牛血清蛋白(BSA)中，分別于室溫和37 ℃下放置1、2、4、6 h，然后取少量樣品用紙層析法測(cè)定其放射化學(xué)純度。

1.5 半胱氨酸置換實(shí)驗(yàn)

取100 μL濃度分別為100、200、300、400、500 mmol/L的半胱氨酸溶液，分別加入純化后50 μL(1.85 MBq)99Tcm-MAG3-RRL混勻后，37 ℃溫育1 h，再同前述紙層析法(展開(kāi)劑為丙酮)計(jì)算半胱氨酸對(duì)99Tcm-MAG3-RRL中99Tcm的置換率。對(duì)照組使用等體積的生理鹽水。計(jì)算公式如下：半胱氨酸置換率(%)=丙酮展開(kāi)劑前沿放射性計(jì)數(shù)/丙酮展開(kāi)劑紙層析總放射性計(jì)數(shù)×100%。

1.6 脂水分配系數(shù)的測(cè)定

在1.5 mL離心管中同時(shí)加入500 μL正辛醇和480 μL磷酸鹽緩沖液(PBS)，再取20 μL99Tcm-MAG3-RRL加入該管，用封口膜密封。充分振蕩1 min后高速離心5 min，靜置10 s。用移液槍分別從有機(jī)相和水相各取樣100 μL液體，并連同槍頭置于干凈的放免管中，分別測(cè)量其放射性計(jì)數(shù)，計(jì)算脂水分配系數(shù) (lgP)。 計(jì)算公式如下：lgP=lg(N(正辛醇)/N(PBS))。其中，N(正辛醇)和N(PBS)分別為所測(cè)正辛醇和PBS的平均放射性計(jì)數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 20.0，多組間比較采用單因素方差分析，若P<0.05則認(rèn)為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 MAG3-多肽的合成和標(biāo)記結(jié)果

圖1 MAG3-RRL HPLC分析結(jié)果Fig.1 MAG3-RRL HPLC analysis results

圖2 MAG3-RRL MS分析結(jié)果Fig.2 MAG3-RRL MS analysis results

2.2 MAG3-多肽的體外穩(wěn)定性結(jié)果

臨床多肽標(biāo)紀(jì)藥盒一般多用可注射生理鹽水稀釋?zhuān)时竟ぷ鞲鶕?jù)臨床實(shí)際情況按室溫下可注射生理鹽水孵育和37 ℃牛血清白蛋白(BSA)孵育1 h來(lái)分別模擬評(píng)價(jià)標(biāo)記藥物的體外穩(wěn)定性。純化后的標(biāo)記多肽在室溫下生理鹽水中放置1、2、4、6 h，放射化學(xué)純度分別為94.00%±1.10%、93.43%±0.83%、93.27%±4.82%、91.06%±2.66%(n=3)。純化后的標(biāo)記多肽在37 ℃下50%BSA中放置1、2、4、6 h，放射化學(xué)純度分別為97.10%±0.27%、96.16%±0.33%、96.26%±0.15%、94.27%±1.14%(n=3)，結(jié)果示于圖4。圖4結(jié)果顯示，99Tcm-MAG3-RRL在生理鹽水和50%BSA中放置6 h以?xún)?nèi)的穩(wěn)定性較好，放化純均在90%以上，其中在50%BSA中的穩(wěn)定性更好。姚寧等[24]報(bào)道，99Tcm-RRL標(biāo)記物在室溫生理鹽水和37 ℃人血清中，其放射化學(xué)純度24 h內(nèi)均大于93%。趙倩等[25]也有類(lèi)似報(bào)道，在室溫/37 ℃的生理鹽水和正常人血清兩種介質(zhì)中共孵育 1、2、4、6 h 后，99Tcm-RRL的放射化學(xué)純度也始終大于93%，且正常人血清中的放射化學(xué)純度在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均大于生理鹽水，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果趨勢(shì)相同。但是本實(shí)驗(yàn)中99Tcm-MAG3-RRL在生理鹽水中的穩(wěn)定性低于前述文獻(xiàn)報(bào)道，提示MAG3的加入可能對(duì)多肽標(biāo)記物在生理鹽水中的穩(wěn)定性有一定影響。

圖3 pH、SnCl2用量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)總體積對(duì)標(biāo)記率的影響Fig.3 Effect of pH, SnCl2 dosage, reaction temperature and total volume of reaction on labeling rate

●——50%BSA，37 ℃；■——生理鹽水，常溫圖4 99Tcm-MAG3-RRL在生理鹽水和50%BSA中的放射化學(xué)純度Fig.4 Radiochemical purity of 99Tcm-MAG3-RRL in normal saline and 50% BSA

2.3 MAG3-多肽的半胱氨酸置換實(shí)驗(yàn)和lg P

由于生物體內(nèi)含有一些游離的巰基化合物，與99Tcm標(biāo)記物在體內(nèi)競(jìng)爭(zhēng)配合，體外半胱氨酸置換實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以間接反映標(biāo)記物在生物體內(nèi)的穩(wěn)定性。純化后標(biāo)記多肽在100 μL 100、200、300、400、500 mmol/L的半胱氨酸溶液中的置換率分別為0.41%±0.14%、0.45%±0.24%、0.53%±0.04%、0.55%±0.17%、0.57%±0.21%，生理鹽水對(duì)照為0.41%±0.04%，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(n=3,P>0.05)。結(jié)果提示：游離锝含量隨半胱氨酸濃度增加而略有增加，在500 mmol/L半胱氨酸溶液下增加約0.16%。這表明99Tcm-MAG3-RRL的體內(nèi)穩(wěn)定性可能較好，不易脫锝。原因可能是因?yàn)镸AG3對(duì)99Tcm的螯合能力比較強(qiáng)，不易受半胱氨酸的影響。99Tcm-MAG3-RRL的脂水分配系數(shù)lgP=-0.15±0.01(n=3)，結(jié)果顯示藥物有一定水溶性。一般親脂性結(jié)構(gòu)更容易與細(xì)胞靶點(diǎn)蛋白結(jié)合，較強(qiáng)的水溶性雖然利于機(jī)體代謝，但是使得標(biāo)記多肽在體內(nèi)循環(huán)時(shí)間過(guò)短 ，不利于在腫瘤處更好富集[25]。總體而言，小分子多肽在體內(nèi)的代謝分布易于優(yōu)化[26-28]。有學(xué)者[29-30]報(bào)道用PEG修飾的多肽探針對(duì)標(biāo)記率、穩(wěn)定性影響較小，且同時(shí)能改善水脂分配，對(duì)于包裹藥物及體內(nèi)的長(zhǎng)時(shí)間循環(huán)提供了良好的條件。

3 結(jié) 論

將MAG3作為雙功能螯合劑連接RRL多肽可進(jìn)一步螯合99Tcm，提高標(biāo)記率至90%以上。同時(shí)99Tcm-MAG3-RRL的制備方法簡(jiǎn)單快速且具有較高的標(biāo)記率及放射化學(xué)純度。此外探針體外穩(wěn)定性較好且具有一定親水性，可為進(jìn)一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。