99Tcm-3PRGD2 SPECT顯像用于胰腺癌荷瘤裸鼠動物實驗及臨床轉化研究

靳曉娜，鄭 堃，石希敏，賈 兵，董誠巖，鄭連芳，杜延榮，霍 力，李 方，*

1.中國醫學科學院 北京協和醫學院 核醫學科，北京 100730；2.核醫學科分子靶向診療北京重點實驗室，北京 100730；3.北京大學 醫學部 同位素中心，北京 100191；4.通用電氣醫療(中國)，北京 100004

整合素(integrin) αvβ3在某些腫瘤細胞和新生血管內皮細胞表面高表達，但在成熟血管和正常的器官系統很少表達或不表達，此特點使其成為腫瘤新生血管顯像及治療的靶點[1-3]。研究證實含有RGD(Arg-Gly-Asp，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)三肽序列的配體與整合素αvβ3具有特異性和高親和力[4-5]。3PRGD2是一種新型RGD二聚體，在兩個RGD模序之間引入PEG4作為連接基團。99Tcm標記的3PRGD2可與整合素αvβ3特異性結合，并進行單光子發射計算機斷層顯像(SPECT)。

近幾年整合素受體顯像已經被用于肺癌、乳腺癌、甲狀腺癌肺轉移的臨床診斷及療效評估，以及腦梗、心梗后的血管新生的評估中，本研究團隊也積累了大量的經驗[6-8]，但國內外尚無其在胰腺癌中應用的報道。胰腺癌是一種具有高度侵襲性和快速進展性疾病[9-10]。在西方發達國家，胰腺癌是第9個最常見的惡性腫瘤和第4個癌癥相關的死亡原因，平均5年生存率不到5%[10]。大多數患者的胰腺癌第一次被發現時，已經出現了嚴重的局部浸潤和/或遠處轉移，從而錯過了根治性手術切除最佳時機，因此可早期診斷和準確評估腫瘤分期的影像學方法顯得尤為重要。因此本研究擬進行動物實驗及初步臨床轉化，探索99Tcm-3PRGD2SPECT顯像應用于胰腺癌的價值。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

HYNIC-3PEG4-E[c(RGDfK)2藥盒(藥盒中含有5 mg三苯基膦三間磺酸鈉、6.5 mg三羥甲基甘氨酸、40 mg 甘露醇、20 μg HYNIC-3PRGD2以及琥珀酸鹽緩沖液成分)，由北京大學醫學部同位素中心王凡教授惠贈；胰腺癌PANC-1細胞，由北京協和醫院基本外科實驗室惠贈；Sep-Pak C18反相萃取柱，美國Waters公司；Muhiscreen抽濾板，美國Millipore公司；Na99TcmO4洗脫液，北京原子高科股份有限公司；鼠抗人整合素αvβ3單克隆抗體，美國Chemicon公司；異硫氰酸熒光素(FITC)標記的羊抗鼠IgG、3-氨丙基-3-甲氧基硅烷(3-aminopropyl-triethoxysilane, APES)，北京中杉金橋生物技術有限公司；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)，美國Biotium公司。

CRC-15R放射性活度計，美國Capintec公司；ITLC-SG紙條，美國Agilent公司；AR-2000放射性掃描儀，Bioscan公司；E.CAM單光子發射計算機斷層掃描儀(SPECT)、biography 128 TrueVTrueX正電子發射計算機斷層掃描儀/電子計算機X射線斷層掃描儀(PET/CT)，西門子公司。

1.2 實驗方法

1.2.1細胞培養和荷瘤鼠模型的建立 將PANC-1胰腺癌細胞用含10%(質量分數，下同)胎牛血清(BSA)的低糖DMEM培養基在37 ℃、5%(體積分數)CO2的培養箱中常規培養傳代。荷瘤鼠模型的建立：取4～5周齡BALB/c裸鼠，于上肢肩部接種PANC-1胰腺癌細胞，每只接種5×106個細胞，飼養于SPF級動物房。待腫瘤平均直徑達到0.8～1.0 cm時用于實驗。

1.2.2免疫組化實驗

(1) 細胞實驗設2個平行組，每組設2個平行樣。一組將待檢PANC-1細胞以1×105mL-1接種到小玻片(細胞爬片)上，培養過夜，用4%(質量分數)多聚甲醛固定20 min。磷酸鹽緩沖溶液(PBS，0.01 mol/L，pH=7.4)洗后用含有1%(質量分數，下同)BSA的PBS封閉1 h。封閉后分別加入鼠抗人整合素αvβ3單克隆抗體( 1∶100稀釋)和人源IgG，4 ℃孵育過夜。用含0.1%(體積分數，下同)Tween-20的PBS洗3次后加入FITC標記的羊抗鼠IgG (1∶200稀釋)和DAPI(用含5%BSA的PBS稀釋成100 ng/L)溶液，室溫下孵育1 h。用PBS洗3次。用蒸餾水沖去鹽分，甘油緩沖液封片。另一組用人源IgG代替鼠抗人整合素αvβ3單克隆抗體。最后置于激光共聚顯微鏡下觀察。

(2) 組織實驗設2個平行組，每組設2個平行樣，將胰腺癌組織冰凍切片取出風干，用冰丙酮溶液浸泡固定10 min，空氣干燥10 min。加含5%BSA的PBS室溫孵育1 h。一組加鼠抗人整合素αvβ3單克隆抗體(1∶100稀釋)，37 ℃孵育1 h。用PBS洗3次，加FITC標記的羊抗鼠IgG(1∶200稀釋)和DAPI溶液，37 ℃孵育1 h。用PBS洗3次。用蒸餾水沖去鹽分，甘油緩沖液封片。另一組用人源IgG代替鼠抗人整合素αvβ3單克隆抗體。最后使用激光共聚顯微鏡觀察。

1.2.399Tcm-3PRGD2標記、質控及安全性檢測 取1 mL Na99TcmO4洗脫液740～1 300 MBq (20～35 mCi)加入到3PRGD2藥盒中。充分振蕩使藥盒中固體樣品徹底溶解至澄清，100 ℃加熱20 min。反應完成后，冷卻至室溫，用0.22 μm無菌濾膜過濾。用無菌生理鹽水稀釋到所需劑量濃度。標記完成后，用無菌注射器取1滴產物溶液點于快速硅膠薄層紙(ITLC-SG)，點樣后分別用檸檬酸-檸檬酸三鈉二水合物緩沖液(體系1，pH=5)和乙腈與生理鹽水混合體系(體系2，體積比1∶1)兩種展開體系上行展開，將層析紙條晾干后，使用Bioscan放射性薄層掃描儀進行數據采集，數據采集完成后獲取圖像、各放射性百分比及Rf值，用于計算藥品的放化純度。產品低溫保存，質控合格后使用。標記3批次，將產品進行細菌培養及細菌內毒素檢測。

1.2.4急性毒性試驗 取6周齡昆明鼠8只，體重(20±5) g，5只為實驗組，3只為對照組。實驗組每只鼠尾靜脈注射99Tcm-3PRGD22 mCi/0.5 mL(1 Ci=3.7×1010Bq)。本研究擬以0.3 mCi/kg的劑量給患者注射99Tcm-3PRGD2，則所給實驗組鼠的劑量是人體的333倍。對照組鼠尾靜脈注射生理鹽水0.5 mL。均于5 s內勻速注射完畢。

1.2.5荷瘤裸鼠全身平面顯像 4只荷瘤裸鼠分別自尾靜脈注射99Tcm-3PRGD2(200 μL，14.8 MBq)，并于注射后0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 h時，將裸鼠腹腔注射10%水合氯醛(劑量3 mL/kg)麻醉后仰臥于配有平行孔低能高分辨準直器的雙探頭SPECT上進行平面顯像。全身采集計數分別為300 k，矩陣大小為128×128。觀察腫瘤對示蹤劑的攝取以及全身分布情況。在腫瘤(T)和健康側對應部位(NT)勾畫的感興趣區(ROI)，獲取感興趣區內最高放射性計數，并計算其放射性攝取比值T/NT，分析它們隨時間變化的規律。

1.2.6初步臨床轉化應用 本臨床研究獲得中國醫學科學院北京協和醫院倫理委員會批準。對6例CT發現胰腺腫瘤患者行99Tcm-3PRGD2SPECT顯像，患者均為男性，年齡51～67(62.4±3.4)歲。靜脈注射99Tcm-3PRGD2，每kg體重注射劑量0.3 mCi(±10%)，注射后1 h排尿后行前后位全身掃描，掃描速率為10 cm/min，后行腹部斷層顯像，約為注射示蹤劑后1.5 h±10 min，其中5例患者于2周內行常規18F-FDG PET/CT檢查。

2 結果與討論

2.1 免疫組化實驗

胰腺癌PANC-1細胞和腫瘤組織切片對鼠抗人整合素 αvβ3單克隆抗體顯示出強陽性免疫染色，以人源IgG作為陰性對照的免疫熒光染色結果為陰性證實了結合的特異性，表明了PANC-1胰腺癌細胞和腫瘤組織中表達整合素αvβ3(圖1)。此結果為本工作的后續實驗提供了分子水平的理論依據。

2.2 99Tcm-3PRGD2標記、質控及安全性檢測

(a)和(c)分別為以鼠抗人整合素αvβ3單克隆抗體為一抗腫瘤細胞和腫瘤組織切片的染色結果，強陽性；(b)和(d)分別為以IgG作為一抗腫瘤細胞和腫瘤組織切片的染色結果，為陰性圖1 胰腺癌PANC-1細胞及腫瘤組織免疫組化染色Fig.1 Integrin αvβ3 expression in PANC-1 cells and tumor tissue by immunofluorescence staining

99Tcm-3PRGD2：(a)——Rf=0.0，(b)——Rf=0.9～1.0圖2 ITLC-SG法質控結果Fig.2 Quality control results of ITLC-SG method

2.3 急性毒性試驗

注射99Tcm-3PRGD2觀察48 h內小鼠無死亡，120 h內實驗組和對照組小鼠飲食、活動均正常。注射后120 h時處死并解剖小鼠，實驗組小鼠各臟器顏色、形態與對照組無明顯差異。急性毒性試驗提示安全性強。

2.4 荷瘤裸鼠全身平面顯像

荷瘤裸鼠全身平面顯像(圖3)提示99Tcm-3PRGD2主要分布于腫瘤、肝臟、雙腎和膀胱，排尿后膀胱內放射性分布明顯減少。心臟、雙肺、肌肉和骨骼對示蹤劑攝取低。 腫瘤在0.5 h即可清晰顯影，肌肉本底較低，說明99Tcm-3PRGD2能夠快速與整合素受體結合，且靶/本底比值較高，T/NT為1.58±0.15。從圖3所示的全身分布情況看，雙腎及膀胱放射性分布多，肝臟次之，腦、心臟、雙肺分布最少，說明99Tcm-3PRGD2主要經腎臟代謝后以尿液形式排出體外。受肝、脾、雙腎及膀胱影響，未觀察到胰腺及腸道攝取。隨時間延長，腫瘤攝取99Tcm-3PRGD2逐漸增加，軟組織本底逐漸降低，1.5 h時T/NT達峰值(圖4)，為2.51±0.54。觀察至6.0 h，腫瘤仍清晰可見，T/NT為1.43±0.06。此實驗為以荷胰腺癌(PANC-1細胞)裸鼠模型為基礎的顯像研究建立了成熟的顯像方法，提供了觀察腫瘤的最佳時間點。注射后6.0 h仍可見腫瘤對示蹤劑有較高濃聚，除了腫瘤、肝、雙腎及膀胱，其他臟器亦未見明顯分布，說明99Tcm-3PRGD2在荷瘤鼠體內穩定性好，持續時間長。

(a)中白色箭頭所指位置為腫瘤圖3 荷瘤鼠全身平面顯像Fig.3 Whole body planar imaging of PANC-1-bearing mice

n=4圖4 T/NT隨時間的變化Fig.4 T/NT variation over time

2.5 初步臨床轉化應用

紅色箭頭：胰腺原發灶；藍色箭頭：肝轉移灶圖5 99Tcm-3PRGD2 SPECT 前(a)、后(b)位全身平面顯像Fig.5 99Tcm-3PRGD2 SPECT anterior(a) and posterior(b) planar scans of the whole body

患者均為男性，年齡51～67(62.4±3.4)歲，檢查過程及檢查后隨訪兩周，未見明顯不適。共發現6個胰腺病灶，分布于胰頭、頸及體尾部，大小約1.5～5.2 cm，手術或穿刺病理結果：導管腺癌4例，腺細胞癌2例。99Tcm-3PRGD2SPECT 全身顯像顯示胰腺癌及肝左葉見示蹤劑濃聚灶(圖5)，肝、脾、腸道、雙腎及膀胱見較多示蹤劑分布，唾液腺及甲狀腺輕度放射性攝取，其余臟器未見明顯示蹤劑分布。99Tcm-3PRGD2SPECT全身及斷層顯像(圖6)檢出所有的胰腺癌原發灶，檢出率為100%，腫瘤/肝臟放射性攝取比值(T/L)為1.7～3.5。18F-FDG PET/CT檢出5例患者中的原發灶，最大標準攝取值(SUVmax)為2.8～9.1，T/L為1.5～4.2。1例胰腺癌患者伴有肝左葉兩處轉移(圖6)，病灶大小分別約為2.6 cm和1.1 cm，較大者對99Tcm-3PRGD2攝取增高，T/L為2.5，較小者對99Tcm-3PRGD2攝取與肝臟接近；肝轉移灶對18F-FDG攝取不同程度增高，T/L分別為1.5(2.6 cm)和2.3(1.1 cm)，說明它們處于不同病理生理狀態，較大者腫瘤細胞的糖代謝相對較低(對18F-FDG攝取較低)，血管新生旺盛(對99Tcm-3PRGD2較高)，較小者對兩種示蹤劑攝取程度相反，這個現象及原因需進行更深入的研究。99Tcm-3PRGD2SPECT檢出了6例胰腺癌患者的原發灶和肝內轉移灶，具有應用于胰腺癌診斷的潛能，并且檢查操作簡單，費用低于18F-FDG PET/CT。本研究僅為初步研究，臨床轉化病例數少，需進行大樣本的臨床研究，以證實99Tcm-3PRGD2SPECT對胰腺癌的診斷價值。

圖6 胰腺癌對 99Tcm -3PRGD2(a)、18F-FDG(b)的攝取，肝轉移灶對99Tcm-3PRGD2(c)、18F-FDG(d)的攝取，以及CT所示胰腺癌病灶(e)及肝轉移灶(f)Fig.6 Intense 99Tcm-3PRGD2(a) and 18F-FDG(b) uptakes in pancreatic cancer, different distribution of 99Tcm-3PRGD2(c) and 18F-FDG(d) in liver metastases, and pancreatic cancer(e) and liver metastases(f) by CT

3 結 論

(1)99Tcm-3PRGD2是一種能夠與腫瘤新生血管內皮細胞和腫瘤細胞表面的整合素受體特異性結合的單光子腫瘤顯像劑。它的制備及質控方法易于操作，并且其具有很好的安全性和顯像效果，適于推廣應用。

(2) 初步的臨床轉化研究提示99Tcm-3PRGD2SPECT顯像對胰腺癌的臨床診斷具有潛在的應用前景。