沙門菌PrgH蛋白的生物信息學分析及其單克隆抗體制備

李 杰， 張聞桐， 黃志強， 劉 濤， 劉 箐

上海理工大學醫療器械與食品學院，上海 200093

沙門菌(Salmonella)屬革蘭氏陰性腸桿菌科，是最早由美國細菌學家Salmon與Smith于1885年發現[1]的一種常見人畜共患病原菌[2]。目前已發現有2 500多個血清型[3]，包括腸道沙門菌和邦戈爾沙門菌兩個種，腸道沙門菌又可分為6個亞種：腸道亞種(S.entericasubsp.enterica)、薩拉姆亞種(S.entericasubsp.salamae)、亞利桑那亞種(S.entericasubsp.arizonae)、雙相亞利桑那沙門菌(S.entericasubsp.diarizonae)、豪頓沙門菌(S.entericasubsp.houtenae)和印度沙門菌(S.entericasubsp.indica)。沙門菌能引起禽傷寒、雞白痢、豬霍亂等動物性疾病，以及人類胃腸炎、類傷寒、敗血癥、感冒等感染型食物中毒。據估計，每年有超過19萬人死于傷寒、甲型、乙型和丙型副傷寒沙門菌[4]，沙門菌感染是威脅人類健康和全球經濟發展的重大疾病[5,6]。

III型分泌系統(Type III secretion systems，T3SSs)是一個多組分蛋白復合體組成的跨膜通道，通過分泌毒力蛋白后直接注入宿主細胞發揮致病作用，是僅存在于致病性革蘭氏陰性菌如沙氏菌、銅綠假單胞菌[7]、耶爾森鼠疫桿菌及志賀菌等[8]的蛋白分泌系統，通常被稱為T3SS注射裝置(injectisome)[9]，用于將毒力蛋白(效應蛋白)像注射器一樣直接注射到宿主細胞以達到侵入并致病的目的[10,11]。在與宿主細胞接觸后，沙門菌T3SSs被激活并分泌的效應蛋白與宿主細胞相互作用，在沙門菌入侵腸道上皮細胞的感染過程中起重要作用[12]，也是在吞噬細胞中存活并引起沙門菌的全身性感染所必需[13]。HU B等[14]通過高通量的低溫電子斷層掃描和亞單位平均技術，原位確定了沙門菌III型分泌機制的完整結構，包括細菌胞外成分、橫跨細胞膜的基體、胞內成分和分子伴侶等四大類，其中主要結構單元基體主要由三種蛋白質組成，他們排列成一系列高度低聚的同心環：包括內膜環(PrgH/PrgK)、輸出裝置、外膜環(InvG)等結構[15]。當T3SS與宿主細胞接觸后，注射裝置被激活，開始于基座的組裝,隨后是針及內桿的組裝,終止于針組裝的完成[16]。T3SS這一復雜的分子裝置中，某一蛋白的功能被破壞都可能威脅到整個系統的功能活性, 因此沙門菌T3SS是重要的藥物靶點[17]。

PrgH是具有脂蛋白的結構修飾單元[18]，分泌后被派送到基體內膜上，低聚合為24個拷貝的穩定外環結構[19]，對T3SS結構的穩定性和功能活性至關重要。我們運用生物信息學手段分析PrgH的理化及結構特性,對不同血清型的沙門菌進行特異性基因prgH的PCR鑒定及關系進化樹分析其蛋白保守性,以融合表達的PrgH蛋白作為免疫原制備了兔多克隆抗體及鼠源單克隆抗體，驗證PrgH的免疫原性。本研究對PrgH蛋白理化及結構特性的分析有助于進一步的了解沙門菌T3SS的結構組成及致病機制；本實驗中制備的針對T3SS結構蛋白PrgH中和抗體較真實的反映PrgH較高的免疫原性，為沙門菌藥物靶點的篩選提供參考，同時制得的多克隆抗體及單克隆抗體抗體或為T3SS抑制劑的ELISA篩選系統提供材料和思路。

1 材料與方法

1.1 材料

(1) 實驗菌株、細胞與動物：研究涉及的標準致病菌菌株包括27株沙門氏菌(表1)及原核表達質粒pET-30(a)為本實驗室保存，原核表達工程菌E.coilDH5α，E.coilBL21購買自天根生物技術有限公司，所有菌株均用LB培養基37 ℃培養；SP2/0小鼠骨髓瘤細胞由上海理工大學有害微生物危害與控制研究所保存；6～8周齡SPF級Balb/c雌性小鼠購買自中國上海杰斯捷實驗動物有限公司。2.5 kg雄性6月齡新西蘭白兔由第二軍醫大學實驗動物中心提供。

(2) 試劑與耗材：一步克隆試劑盒(OneStep Cloning Kit)購自南京諾唯贊生物科技有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropy-β-D-thiogalactoside, IPTG)一步法細菌活性蛋白提取試劑盒(One Step BacterialActive Protein Extraction Kit)和 His 標簽純化柱(Ni-IDA-Sefinose Column)購自生工生物工程(上海)股份有限公司；瓊脂糖割膠回收試劑盒(BioSpin GelExtraction Kit)和質粒抽提試劑盒(BioSpin PlasmidDNA Extraction Kit)購自杭州博日科技生物有限責任公司；DMEM高糖細胞培養基購自GIBCO公司；辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase, HRP)標記的山羊抗兔二抗、辣根過氧化物酶(horse reddish peroxidase，HRP)標記的羊抗鼠IgG抗體購自美國Sigma公司；胎牛血清購自BIOSUN公司。

表1 實驗涉及菌株及編號

1.2 方法

1.2.1PrgH的生物信息學分析

從綜合性數據庫NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed )中檢索prgH的基因序列(Gene ID: 1254397)。PrgH蛋白(P41783)氨基酸序列來自蛋白數據庫Uniprot(http://www.uniprot.org/)。PrgH蛋白的三維結構信息來自結構數據庫RCSB-PDB(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)，并在數據庫中對蛋白的一級，二級，三級結構進行分析。運行ExPASy 的ProtParam[20](https://web.expasy.org/protparam/)程序分析預測PrgH 的理化性質。運行SignalP 5.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)程序預測PrgH是否含有信號肽及其剪切位點。運用跨膜分析軟件TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)及二級結構預測軟件PSIPRED(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)預測PrgH是否為膜上蛋白及其跨膜區域跨膜。運用分子三維結構分析軟件Pymol對PrgH三維結構進行展示與分析。

1.2.2引物設計與合成

鼠傷寒沙門氏菌SalmonellaentericaserotypeTyphimurium LT2 (S. Typhimurium LT2)菌株是研究沙門氏菌的模式菌株，根據NCBI數據庫上公布的沙門氏菌LT2菌株上prgH序列(Gene ID：984739)，運用Primer3[21](http://primer3.ut.ee/)設計鑒定引物F1-R1，用于目的基因prgH在實驗室保存的沙門菌的廣譜性分析。根據一步克隆法要求設計擴增目的片段的引物F2-R2，構建連接目的基因的重組質粒，用于目的基因測序后系統進化樹的分析以及蛋白的原核表達。所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司成。

1.2.3序列廣譜性鑒定及系統進化樹構建

為檢測目的基因prgH在27株沙門菌的廣譜性，用F1-R1以27株沙門菌為模板進行 PCR擴增，通過瓊脂糖凝膠電泳(AGE)來分析目的基因prgH的廣譜性。用F2-R2擴增27株沙門菌的prgH片段連接至pET30a載體，將構建成功的重組質粒導入大腸桿菌DH5α，陽性菌經擴大培養后抽取質粒，送至上海華大基因科技有限公司進行測序，將測序結果運用MEGA 7.0[22]構建NJ(Neighbor-joining)[23]系統進化樹，采用p-distance[24]法計算進化距離。

1.2.4PrgH原核表達及純化

根據進化樹結果，以序列同源性最高的沙門菌SalmonellaTyphimurium ATCC 14028為模板對目的片段prgH進行擴增。PCR產物純化后的目的片段用一步克隆試劑盒重組至質粒pET30a上，將重組質粒pET30a-prgH轉化到EcoliDH5α感受態細胞中，50 mg/mL卡那霉素抗性篩選及PCR鑒定為雙陽性的菌落，擴大培養后抽提質粒送至上海華大基因科技有限公司進行測序。將測序正確的重組質粒轉入表達菌EcoliBL21(DE3)，培養BL21-pET30a-prgH至對數生長期，即OD600 nm為0.6～0.8時加入誘導表達劑0.2 mmol/L IPTG，誘導表達4 h。采用一步法細菌活性蛋白提取試劑盒從EcoliBL21(DE3)中提取可溶性蛋白，之后用8 mol/L尿素處理包涵體，SDS-PAGE鑒定重組蛋白的誘導表達情況。

300 mL LB培養基培養BL21-pET30a-prgH，誘導表達后富集菌體后用10 mL 0.01 M磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)緩沖液重懸，重懸液于冰浴超聲破碎(5 s,10 s,40 min,150 W)，12 000 r/min離心20 min，分離收集上清，沉淀用8 mol/L尿素于37 ℃處理1 h，12 000 r/min離心20 min后留上清即為包涵體蛋白。根據Ni-NTA親和層析柱試劑盒說明分別對胞質活性表達蛋白及包涵體表達蛋白進行純化。

1.2.5動物免疫

取5只6～8周齡SPF級 Balb/c雌鼠體重18±2 g左右，耳標編號NO.1～NO.5，對小鼠采用小腿肌肉注射PrgH進行免疫。共免疫3次：第一次為PrgH蛋白與弗氏完全佐劑1∶1混合液，注射劑量為100 μg/只；于第三周及第四周加強免疫2次，將PrgH蛋白于弗氏不完全佐劑1∶1混合，注射劑量為100 μg /只。對6周齡新西蘭白兔頸背部皮下多點注射進行免疫，免疫劑量為500 μg/只，首次免疫后第三周、第五周、第六周加強免疫三次。

卡夫卡與父親關系的奇特之處在于，“A給B一個坦率的、與他的人生觀相符的、不太美的、但卻是今天在城市里很有普遍意義的、也許能防止健康受損的建議。這個建議對B在道德上沒有多大鼓舞力量，但他難道就不能隨著歲月的推移逐漸從這種損傷中擺脫出來嗎？再說，他并不是非聽從這個建議不可的，何況僅僅在這個建議中也看不出促使B的整個未來世界將崩潰的因素。但事情偏偏還是這樣發生了，原因僅僅在于；你是這個A，我是這個B”[4]461-501。

1.2.6多克隆抗體制備及其效價測定

新西蘭兔免疫前耳緣靜脈采血作為陰性對照，最后一次加強免疫一周后心臟采血;室溫放置1 h后4 ℃靜置過夜，待血清析出后4 000 r/min離心10 min，分離后的血清經飽和硫酸銨沉淀，12 000 r/min離心30 min后獲得的沉淀即為PrgH兔多克隆抗體，最后將抗體置于-20 ℃冰箱中保存備用。酶聯免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)測定多克隆抗體與PrgH蛋白以及不同血清型沙門菌的結合情況。具體操作為：30 μg/mL PrgH, 100 μL/孔或者108CFU每孔沙門菌加入96孔板中，4 ℃過夜包板； PBST洗板3次后加入200 μL 3%脫脂乳粉封閉液，37 ℃孵育2 h；洗板后加入100 μL 1∶1 000～1∶2 048 000倍比稀釋的PrgH多克隆抗體，37 ℃孵育1 h；洗板后加入100 μL/孔的TMB顯色液，37 ℃避光反應15 min；加入50 μL/孔2 mol/mL的濃硫酸終止液后測定450 nm波長處的吸光值。

1.2.7單克隆抗體制備及其效價測定

小鼠三免后一周尾靜脈取血，間接ELISA 測定NO.1—NO.5五只小鼠血清中特異性抗體水平，抗體效價最高的小鼠在沖擊免疫后三天用于細胞融合。具體操作為：摘眼球取血作為陽性血清，小鼠脫頸處死后取脾細胞，實驗中以50% PEG(MW2000)作為促溶劑誘導小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合，用含HAT/HT選擇性培養基對雜交瘤細胞進行篩選，間接ELISA法測定孔板細胞培養液中抗體的效價確定陽性孔，采用有限稀釋法對陽性孔進行單細胞克隆，篩選出穩定產生特異性抗體的單細胞株即為單克隆抗體雜交瘤細胞株。

將篩選的雜交瘤細胞株擴大培養，調整細胞濃度2×106細胞/mL，選取8周齡Balb/c雌性小鼠5只，腹腔注射液體石蠟0.3 mL/只，7 d～14 d后，腹腔注射雜交瘤細胞0.3 mL/只，10 d左右活體抽取腹水，4 ℃、5 000 r/min離心10 min，腹水經飽和硫酸銨沉淀初步純化后，用Protein-G柱親和層析進行純化，SDS-PAGE檢驗抗體純化效果。ELISA測定單克隆抗體與PrgH以及不同血清型沙門菌的結合情況并利用抗體亞型試劑盒對單克隆抗體的亞型進行測定。

2 結果與討論

2.1 PrgH的理化性質

NCBI及Uniprot數據庫注釋PrgH的基因全長1 179 bp，編碼392個氨基酸。經ProtParam軟件分析，PrgH相對分子量為44 460，等電點理論值5.73，酸性氨基酸總數(Asp+Glu)為50個，堿性氨基酸總數(Arg+Lys)為45個，不穩定指數為45.55，屬不穩定蛋白，在大腸桿菌體內的半衰期大于10 h(原核表達蛋白時間)，脂肪族氨基酸指數為88.57，平均親水系數為-0.391，為親水性蛋白。

2.2 PrgH的信號肽分析

SignalP-5.0對PrgH的信號肽預測結果如圖1所示，兩種常規分泌通路(Sec/SPI)，(Sec/SPII)以及雙精氨酸轉移通路(Tat/SPI)的信號肽的可能性都小于0.1，表明PrgH中不存在信號肽片段，不是分泌蛋白。

圖1 PrgH信號肽預測

2.3 二級結構分析

2.4 三級結構分析

三維結構6duz.pdb是由HU J[25]等利用透射電鏡研究所得晶體衍射結構，由PrgH(172-364)與PrgK聚合而成的48聚體，是T3SS高度低聚化的空環結構，其中PrgH為外環，PrgK為外環。經過軟件Pymol處理，去掉PrgK結構后展示的PrgH 24聚體環狀結構如圖3-A所示，共由24條重復單鏈 A,B,C,D,E,F,G,H,I,J,K,L,M,N,O,P,Q,R,S,T,U,V,W,X聚合而成，其中圖3-B為單鏈A的三維結構。圖3-C為Pymol展示的三維結構3j1w.pdb是BERGERON JR[26]等利用透射電鏡研究所得晶體衍射結構，由PrgH(14-119)的24條單鏈聚合而成，圖3-D所示三維結構圖為Pymol展示的PrgH(14-119)單鏈A。

A. PSIPRED預測的PrgH二級結構；B. TMHMM對PrgH跨膜結構分析；C. MEMSAT-SVM預測跨膜螺旋結構
圖2 PrgH二級結構分析及跨膜結構預測

2.5 prgH保守性鑒定及進化樹構建

(1) 目的基因prgH的鑒定引物為F1-R1，其中上游引物F1序列為：5′-CTGCTTCAGGTCAACTCCCT-3′；下游引物R1：5′-ATAACCTTCCGCCCCGTAC-3′，鑒定目的片段的長度為995 bp。F1-R1引物用于目的基因prgH在實驗室現有沙門菌中的覆蓋率分析，PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳分析結果如圖4所示，prgH在27株沙門菌(菌株編號如表1)中的覆蓋率高達100%，且目的片段大小在995 bp左右。

(2) 根據一步克隆法要求設計用于質粒重組的引物F2-R2，其中上游引物F2序列為：5′-GCCATGGCTGATATCGGATCCATGGAAACATCAAAAGAGA-A3′；下游引物R2：5′-GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTAAAGTGGGCTTGGGAAAT-3′，上下游引物分別引入BamH I和XhoI酶切位點(下劃線處)。引物F2-R2用于將26株不同的沙門菌的目的片段prgH重組到質粒pET30a，測序后結果由MEGA7構建NJ進化樹進行分析，結果如圖5所示，該方法給出了樹枝長度和為0.025 365 78的最優進化樹，選擇Bootstrap consensus tree[27]，系統發生樹中絕大多數節點處的數值≥70，反映該進化樹的可信度較高。將prgH序列經blastn比對，顯示同源性均高于99%，其中目的基因prgH在SalmonellaTyphimurium ATCC 14028與模式菌株SalmonellaTy-phimurium LT2中同源性為100%，故選做蛋白表達的模板菌株。

A. PrgH (172-364) 24聚體三維結構；B. PrgH (172-364) 單鏈A三維結構；C. PrgH(14-119)24聚體三維結構；D. PrgH(14-119)單鏈A三維結構，所有結構圖均Pymol軟件處理并展示

圖3 PrgH三維結構圖

圖4 prgH在27株沙門菌中的PCR鑒定

2.6 原核表達與純化

重組質粒pET30a-prgH表達蛋白的大小為55 000，SDS-PAGE結果如圖6中的泳道8所示，pET30a-BL21-prgH的誘導表達效果明顯，在55 000處有明顯的蛋白條帶，與預期大小一致，因此PrgH在BL21(DE3)菌體內以包涵體的形式成功表達。包涵體表達蛋白用8 mol/L尿素處理并用His標簽純化柱純化，經6 mol/L、4 mol/L、2 mol/L，PBS梯度復性處理后分裝-20 ℃放置備用。

2.7 多克隆抗體效價測定

采用間接ELISA 法測定多克隆抗體效價，OD450 nm值大于陰性對照(Negative control，NC)2.1倍的最高稀釋度即為最終效價。由圖7-A可知,以PrgH多次免疫后兔血清抗體水平達到較高值，效價可達到1∶1 024 000+，兔血清抗體能與27株沙門菌較好地結合(圖7-B)。PrgH具有較高的免疫原性且作為免疫原制備的多克隆抗體能夠廣泛覆蓋實驗室現有的27株不同血清型的沙門菌。

2.8 單克隆抗體制備及其特性

NO.1-NO.5五只小鼠三免后一周尾靜脈取血，間接ELISA 測定小鼠血清中特異性抗體效價均高達1∶128 000，結果如圖8-A所示，取NO.5號小鼠加強免疫后進行細胞融合，篩得兩株能夠穩定產生特異性抗體的雜交瘤細胞，經親和層析柱純化后所得單克隆抗體命名為4G7，4E2。如圖8-B所示，分別有一條55 000左右的重鏈和26 000左右的輕鏈，且抗體純化效果較好。間接ELISA測定抗體亞型發現兩株單克隆抗體均為IgG2b，抗體效價測定結果如圖8-C，8-D所示，4G7，4E2效價分別為1∶2 048 000+，1∶1 024 000，均具有較強的親和力。

圖5 PrgH關系進化樹

Maker：180KD；1：pET30a-BL21未誘導表達胞質蛋白；2：pET30a-BL21誘導表達胞質蛋白；3：pET30a-BL21-prgH未誘導表達胞質蛋白；4：pET30a-BL21-prgH誘導表達胞質蛋白；5：pET30a-BL21未誘導表達包涵體蛋白；6：pET30a-BL21誘導表達包涵體蛋白；7：pET30a-BL21-prgH未誘導表達包涵體蛋白；8：pET30a-BL21-prgH誘導表達包涵體蛋白。

圖6 PrgH誘導表達及鑒定

A. PrgH兔多抗血清與PrgH結合情況；B. PrgH免疫兔多抗血清與沙門菌結合情況圖7 PrgH免疫兔多抗血清抗體滴度的ELISA測定

3 結論

應用生物信息學工具對沙門菌T3SS的核心結構蛋白PrgH蛋白的理化性質，二級、三級結構以及跨膜區域進行了比較系統的分析，結果表明PrgH是一種單次跨膜、親水性的不穩定蛋白，無分泌信號肽，在T3SSs中以24條單鏈高度低聚為穩定的空環結構存在。prgH在沙門菌中的PCR鑒定顯示，目的基因在27株不同血清型沙門菌的覆蓋率為100%。26株沙門菌中目的片段測序后建立了可信度高的關系進化樹，目的基因在的blastn比對結果顯示同源性高達98%，prgH在沙門菌中高度保守。融合表達并純化后的PrgH蛋白進行動物免疫，制得的兔多克隆抗體效價高達1∶1 024 000+，且能與27株沙門菌較好的結合。篩得兩株單克隆抗體4E2，4G7，效價分別為1∶1 024 000，1∶2 048 000+，均能與目的蛋白發生特異性抗原抗體反應，證明PrgH具有較高的免疫原性。

現有針對沙門菌感染的主要治療方案仍然是抗生素[28]，但是隨著抗生素的濫用，細菌耐藥性成為日益嚴重的問題[29，30]，更多抑菌藥物及疫苗的開發至關重要。T3SS在沙門菌致病方面起到重要的作用，而且結構成分蛋白高度保守，是開發抗菌藥物有效靶標。PrgH作為T3SS的主要結構蛋白，在T3SS的結構模型完整性以及毒力因子的高效轉運中起到至關重要的作用，對PrgH進行結構，功能及免疫原性分析以及制備的單克隆抗體或可為沙門菌藥物靶標的篩選提供理論及實驗基礎。本實驗有助于針對沙門菌設計合理的預防及治療策略，研發新的沙門菌檢測方法及治療藥物，將對沙門菌感染的預防和控制有著重要的意義[31]。

A.五只小鼠3免后效價測定；B.抗體4G7,4E2純化效果；C.抗體4G7效價測定；D.抗體4E2效價測定圖8 單克隆抗體及其效價