零熱量甜味劑D-阿洛酮糖的研發進展

黃擎宇， 徐 錚*， 熊 強， 張 倩， 李克文， 徐 虹

1.南京工業大學食品與輕工學院 材料化學工程國家重點實驗室，江蘇 南京 211816；2.保齡寶生物股份有限公司，山東 禹城 251200

目前，世界范圍內的肥胖、糖尿病、高血壓和高脂血癥等體重過度增加相關疾病的患病率和發病率顯著增加，而高脂肪高熱量食品是導致這種情況的主要原因。在中國這一現象尤為嚴重，肥胖患者與糖尿病患者數量已接近2億，并呈現出低齡化趨勢。在這一環境下，人們越來越重視食品的安全性和對人體健康的影響。低熱量、具備多種功能的食品因此在市場上越來越受到消費者歡迎，對此類食品的研究與開發成為了國內外學者的關注重點。D-阿洛酮糖是一種自然界存在極少的稀有糖，由于其對健康的益處，許多團隊陸續開始對其在功能性食品領域的研究與開發進行研究。

1 D-阿洛酮糖簡介

1.1 物理化學性質

D-阿洛酮糖(D-psicose/D-Allulose)是一種稀有糖，甜度為蔗糖的70%[1]，作為碳水化合物的不可發酵組分以及作為農產品中的游離糖存在。D-阿洛酮糖為白色粉末狀晶體，溶于水、甲醇、乙醇等，是D-果糖的C-3差向異構體(見圖1)，IUPAC名為(3R,4R,5R)-1,3,4,5,6-pentahydroxyhexan-2-one。D-阿洛酮糖化學式為C6H12O6，摩爾質量為180.156 g/mol，熔點為109 ℃，PSA118.22，CAS號551-68-8。安全性方面，D-阿洛酮糖已在2014年通過了美國FDA安全認證，2015年獲得了GRAS的認證[2]。

圖1 D-阿洛酮糖和D-果糖的化學式

1.2 現有來源

自然界中天然存在的D-阿洛酮糖含量極少，來源于少部分植物和少數細菌。2006年，香川大學IZUMORI團隊測定了日常生活中不同食品的D-阿洛酮糖的含量并公布了部分數據[3](見表1)。他們在實驗中發現，各種食品中的D-阿洛酮糖含量與制糖過程中的糖濃度，溫度和加熱時間密切相關。

表1 不同食品中的D-阿洛酮糖含量[3](μg/g)

1.3 功能性

日本科學家TAKATA等[4]通過建立并研究神經毒素6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamin,6-OHDA)誘導嗜鉻細胞瘤細胞凋亡的體外帕金森氏病模型，發現D-阿洛酮糖對于細胞凋亡的抑制展示出了特殊效果,說明其可以起到保護神經的作用。在治療神經變性疾病時，由于D-阿洛酮糖可促進內谷胱甘肽的增量調節，因而有望作為保護劑進行研發。

相對其他稀有糖，D-阿洛酮糖能更加有效地清除活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)和抑制其產生的能力[5]，對先天免疫系統具有保護作用，這種功能對于防治多種疾病具有潛在的價值。例如D-阿洛酮糖能夠抑制ROS在睪丸組織中產生，從而阻止由di-(2-eth-ylhexyl)phthalate(DEHP)誘導的睪丸損傷，同時對氧化劑介導的睪丸損傷起到保護作用。由于對前炎性細胞活素有抑制作用，D-阿洛酮糖可以使炎性反應中斷起到抗炎效果[6]；通過調節p38-促分裂原活化蛋白激酶(p38-Mitogen-Activated Protein Kinase)，單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)的表達可被D-阿洛酮糖抑制，這在動脈粥樣硬化治療時可以發揮作用[7]。

D-阿洛酮糖的甜度在相當于蔗糖甜度的70%的同時幾乎不含熱量，在美國被稱為最具潛力的蔗糖替代品。IZUMORI團隊[8]2006年的小鼠實驗表明了相較于攝入其他糖類的小鼠組，攝入D-阿洛酮糖的小鼠血糖水平均比較低，后經分析得知D-阿洛酮糖可以通過對脂肪肝酶和腸道α-糖苷酶的抑制，從而降低小腸對糖類的吸收速率來減少體內脂肪的積累并抑制血糖濃的上升，可以用于對糖尿病Ⅱ型的治療[9]。在日本自治醫科大學的研究人員發布的一項小鼠實驗的結果中[10]，他們通過實驗發現D-阿洛酮糖可以促進“GLP1”的分泌，而GLP1可促進胰島素分泌、抑制食欲，能有效治療糖尿病。此外，HAYASHI和IIDA等人[11]通過臨床試驗結果證明了日常飲食中添加D-阿洛酮糖能降低餐后血糖水平，以及提高胰島素的敏感性和葡萄糖耐受性，大部分D-阿洛酮糖在小腸中被吸收并通過尿液從體內排泄出去。

除了醫療價值，D-阿洛酮糖的口感和甜度與蔗糖相近，作為一種功能性甜味劑還能夠彌補傳統的甜味劑的不足，可以改善食品的風味、色澤、外觀和口感，具有延長貨架期等作用[12]。添加了D-阿洛酮糖的食品的膠凝度不僅可以得到提高，其風味也能夠被改善。同時D-阿洛酮糖還可以和食品蛋白發生美拉德反應[13]可以形成較好的交聯結構，改善食品質構，并使食品在抗氧化性方面也有所提升[14]。在食品的加工中，利用D-阿洛酮糖與蛋白的美拉德反應制成的功能性食品和特醫食品可對某些特定疾病進行防治，例如預防由氧化應激導致的疾病、抗齲齒等[15]。

D-阿洛酮糖對植物也有一定影響。香川大學農學研究所的研究人員稱發現了幾種稀有糖誘導水稻等害蟲防御相關基因的表達，同時他們正在研究稀有糖對調節植物生長的作用，以及用于抗病誘導和生長調節的材料的開發[16]，而D-阿洛酮糖就包含在這些稀有糖中。

2 D-阿洛酮糖的合成生產研究進展

2.1 化學法制備技術

阿洛酮糖的研究到今天約有28年的歷史[17]。迄今為止，D-阿洛酮糖的制取有生物合成法和化學合成法兩種。首先討論的是化學合成法，在2017年授權的一項專利(授權公告號：CN104447888B)[18]中，研究人員主要采用化學方法，選取價格較為低廉的葡萄糖作為原料，選擇無機材功能料鉬酸鹽作為催化劑，在80 ℃～120 ℃加熱后經催化轉化、分離提純得到產物D-阿洛酮糖。產物通過有機溶劑法進行降溫結晶得到的D-阿洛酮糖產品，其含量可達98.5%～99.5%。相較于生物酶法生產D-阿洛酮糖出現的轉化效率低，反應慢、耗時長的問題，化學合成法的優勢十分明顯。但化學合成存在著純化步驟較復雜，會產生化學廢料和無價值副產物等問題[19]，同時化學合成甜味劑甜味往往不夠純正，此法的產物與天然存在的D-阿洛酮糖口感是否存在差距還有待考證。并且化學合成法的應用并不廣泛[20]，D-阿洛酮糖實際上難以化學合成[21]。

2.2 生物法制備技術

2.2.1菌種和酶

酶作為催化劑在精細化學品制造和食品加工等不同領域占有重要地位[22]，當今世界上生產D-阿洛酮糖的主要方法是以酶作為催化劑的生物合成法。在國外，日本香川大學的IZUMORI, YAMAKITA等人[17]1990年從菊芋假單細胞菌(Pseudomonascichorii)中分離純化得到D-塔格糖-3-差向異構酶(D-tagatose 3-epimerase,DTEase)，首次描述了以D-塔格糖等為底物用生物方法合成D-阿洛酮糖的過程,并根據用于表征細菌的標準試驗中的菌株的結果將該生物體表征為產堿菌屬(Alcaligenessp.701 B)。這次的探索象征著D-阿洛酮糖生物轉化生產的開始，該轉化法也屬于后來提出的Izumoring法[23]。目前，已經被發現并表征的可用于D-阿洛酮糖生物法合成的生物催化劑有D-阿洛酮糖-3-差向異構酶(D-psicose 3-epimerase,DPEase) 和D-塔格糖-3-差向異構酶，并且大多數情況選擇D-果糖通過這兩種酶催化轉化來制取D-阿洛酮糖。已發現可產生DTE酶的菌種有菊芋假單細胞菌和類紅球細菌[24](Rhodobactersphaeroides)等；DPE酶的來源較多，包括根癌土壤桿菌[25](Agrobacteriumtumefaciens)、解纖維梭菌[26](Clostridiumcellulolyticum)、瘤胃菌[27](Ruminococcussp.)、梭狀芽孢桿菌[28](Clostridiumbolteae)、梭菌屬[29](Clostridiumsp.)和螺旋梭菌[30](Clostridiumbolteae)等。

在使用過程中，酶的保存是極為重要的一環，能夠延長酶的儲存壽命并保持穩定性是將其投入商業應用的基礎。江南大學的研究人員通過對比不含添加劑的DPE酶與加入一些常用的提高酶穩定性的化學添加劑的DPE酶在15 d和30 d后的活性，得出結論MnSO4和乙二醇對于提高DPE酶的穩定性和儲存有很大的幫助[31]。TSENG等人[32]發表了關于來源有Agrobacteriumsp. ATCC 31749的DPE酶研究成果的論文，文中提到他們發現ATCC 31749產出的DPE酶活性高于來源于根瘤土壤桿菌的DPE酶，除此之外還鑒定出殘留N234作為重要的界面殘基，對酶活性的影響極為顯著。隨著專家學者們越來越關注，有關DPE酶與DTE酶在保存、提高酶活等方面的研究也會成為D-阿洛酮糖研究中的熱點。

2.2.2國內外發展動向

韓國CJ第一制糖株式會社和日本松谷化學工業株式會社是當今世界上生產D-阿洛酮糖主要的廠家[21]。松谷化學工業[33]主要是利用從不具有植物病原性的節桿菌(Arthrobactersp.ConnandDimmick)中得到的新型酮糖3-差向異構酶催化D-阿洛酮糖和D-果糖之間的互相轉化，這與先前相比更適用于工業化生產。2011年授權的一項專利中，韓國CJ第一制糖株式會社[34]的研究人員克隆了源自根瘤土壤桿菌的DTE酶并表達，首次證明了只有源自根瘤土壤桿菌ATCC33970的DTE酶具有具有將D-果糖轉化為D-阿洛酮糖的能力(圖2)。

圖2 簡易工藝流程圖

D-果糖和D-阿洛酮糖之間的轉化是可逆反應，如果能夠使反應平衡朝著生成-阿洛酮糖的方向移動，即可大幅度提高轉化率。2008年，韓國世宗大學Oh團隊[35]實驗發現，隨著硼酸鹽的加入，平衡逐漸向D-阿洛酮糖方向移動，當硼酸鹽與D-果糖的摩爾比達到0.6時達到最大轉化率，約為無硼酸鹽加入時的兩倍。研究人員解釋為由于硼酸鹽對不同糖親和力不同，其對D-阿洛酮糖的親和力要高于對D-果糖，因而與D-阿洛酮糖結合形成D-阿洛酮糖-硼酸鹽復合物，且形成的復合物不參與反應。

重組后的大腸桿菌細胞生產效率明顯提高，非常適合用于D-阿洛酮糖的生產。但大腸桿菌是一種潛在病原菌[36]，不是公認的安全菌株，且產物多為包涵體，在食品及醫藥等行業的使用受到限制。2016年，Oh團隊在將D-果糖轉化為D-阿洛酮糖時嘗試了用GRAS菌株谷氨酸棒狀桿菌作為宿主表達DPEase基因，研究不同pH，溫度，金屬離子和細胞及底物濃度等條件對反應的影響，發現金屬離子Co2+對提升酶的活力的作用最為明顯。此外，谷氨酸棒狀桿菌經過透化后在優化條件下進行反應，通過Bio-LC系統(Dionex ICS-3000,USA)用電化學檢測器和CarboPac PA10色譜柱測定單糖濃度。分析得到，10 g/L透性細胞可使750 g/LD-果糖產生235 g/LD-阿洛酮糖，轉化率達到31%(w/w)，是非透性細胞的1.4倍[37]。

在國內，江南大學江波團隊[23]在2008年對魚塘淤泥、水樣中富集分離的細菌進行分析篩選，得到一株轉化率較高的類紅球細菌(RhodobacterphaeroidesSKO11)，其產率達到6.54%。2011年該團隊以微生物ClostridiumcellulolyticumH10的基因為模板，通過基因合成成功獲得了DTE的編碼基因，并采用1 mmol/L的IPTG在28 ℃下誘導6 h后在大腸桿菌中成功表達[26]。天津工業生物技術研究所研究人員柏瑋等人[38]將來源于ClostridiumcellulolyticumH10的DPE基因與根癌土壤桿菌的DPE基因比對發現兩者相似度為60%，同樣可以催化D-果糖和D-阿洛酮糖的互相轉化。該方法中，經過在37 ℃下培養16 h后得到的ClostridiumcellulolyticumH10的基因在枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)中進行表達，采用粗提取、親和層析、離子交換色譜三步方法得到純化的重組DPE蛋白，用其在50 ℃催化D-果糖1 h后反應達到平衡，D-果糖轉化率為27.34%。

D-葡糖糖被廣泛應用于制取D-果糖，為了獲得更廣泛的原料來源和降低成本，日本的研究人員在1995年就進行了以D-葡萄糖為底物轉化D-阿洛酮糖的實驗，但是轉化率只有10%[39]。2016年，我國江波團隊以D-葡糖糖為原料對D-阿洛酮糖的轉化進行了更徹底的研究[40]。研究人員在Izumoring法的基礎上，把D-果糖與D-葡萄糖偶聯作為中間體，嘗試從D-葡萄糖中獲得D-阿洛酮糖。 其原理為先將D-葡萄糖通過D-葡糖糖異構酶(GIase, EC 5.3.1.5)轉化為D-果糖，同時立刻用DPEase將轉化出的D-果糖異構化為D-阿洛酮糖。研究發現在pETDuet-Glase/DPEase共表達系統中溫度是影響反應的最主要因素，當處于65 ℃～75 ℃時系統高度活躍，相對活性保持在88%以上。當反應在最佳條件下達到平衡時，D-阿洛酮糖、D-果糖和D-葡萄糖的平衡比約為3∶7∶6.5[40]。研究人員還指出加入硼酸鹽作為一種有效手段，有望幫助該體系轉化率獲得進一步提高。市場上D-葡萄糖比D-果糖更為常見且價格更為低廉，D-葡萄糖作為原料可以大大減少生產成本，這一方法為以D-葡萄糖為原料轉化D-阿洛酮糖的工業化生產提供了實踐依據。

3 D-阿洛酮糖的分離純化

以D-果糖為原料的生物法生產D-阿洛酮糖的產物為D-阿洛酮糖和D-果糖的混合物，并且D-果糖占產物的大部分，因此如何從混合物中分離純化出D-阿洛酮糖具有重要意義。

2000年，香川大學IZUMORI團隊在制取D-阿洛酮糖時為了從混合物中分離出D-阿洛酮糖，選擇了在發酵D-果糖時使用面包酵母而不使用柱層析。研究人員將反應產物在有氧條件下在40 L的罐子中用面包酵母處理24 h后，HPLC圖像顯示D-果糖已被全部降解，再在35 ℃下真空蒸發使上清液濃縮為糖漿后使用乙醇沉淀純化結晶，60 d內可獲得約20 kg的D-阿洛酮糖晶體。這種方法的優點十分明顯，簡單的操作和低廉的成本并可節省大量勞動力，使得其具有應用于大規模生產并處理D-阿洛酮糖的潛力[41]。

雖然使用面包酵母的分離方法具有一定優勢，但實際情況中例如長時間的細菌污染等問題的影響使其的應用仍未普及。目前，模擬移動床(SMB)工藝是世界上工業生產中分離時常用的手段，其固定相和流動相的有效使用以及操作的連續性有助于減少溶劑的消耗和促進生產率的提高。韓國仁荷大學的研究人員使用裝有Dowex 50WX4-Ca2+離子交換樹脂的四柱模擬移動床，基于三角理論設計并模擬了分離D-阿洛酮糖和D-果糖的SMB過程，最終在穩態下分離出的D-阿洛酮糖純度達到99.36%[42]。該結果證明了SMB方法(圖3)的實用性，并為工業大規模處理含有D-阿洛酮糖混合物的進一步研發奠定基礎。

圖3 SMB流程簡圖[42]

離子交換樹脂分離作為制糖工業中常用的分離方法，江南大學的研究人員在2011年采用該方法對不同條件下D-阿洛酮糖的分離效果進行了測定，實驗得出進樣量10 mL，柱溫60 ℃，填料體積400 mL，去離子水為流動相，流速1 mL/min時為最佳分離條件，在此條件下可獲得純度為98.3%的D-阿洛酮糖[43]。

4 D-阿洛酮糖應用前景

2014年，世界衛生組織(WHO)發布了《成人和兒童糖攝入量指南》，該指南建議人們對“游離糖”攝入最好不超過總能量攝入的5%[44]，而這里所指的“游離糖”即傳統甜味劑如蔗糖、果糖等。2015年，我國甜味劑年產量由2010年的9.3萬噸達到了15.4萬噸，每年都在穩定增長。與此同時，新型甜味劑在2016年也已經占據了市場規模的約82%。因此，具有特殊功能，有益健康的D-阿洛酮糖有著極為廣闊的前景。

D-阿洛酮糖對于食品的風味、色澤、外觀、口感進行改善的作用，可以用于冰激凌，巧克力等一些誘人但易發胖的食物中，一方面保證口感的同時降低熱量減少發胖的擔憂，另一方面可增加食品的銷量；也可以代替薯片，口香糖等日常零食中的阿斯巴甜，做到更加安全衛生，并減少食品的加工和貯藏中的氧化損失[45]。除了日常食品中可加入D-阿洛酮糖外，將其做成特醫食品也是很好的選擇，針對糖尿病人、肥胖癥患者等人群，做成的食品可以幫助抑制血糖升高和減少脂肪在身體內的積累。D-阿洛酮糖對于神經系統的保護作用使其可以作為保護劑制成神經保護類藥物、保健品等；同時在清除ROS、抗齲齒和應對氧化應激導致的疾病中的突出表現令其也具有被開發成藥物的潛力。此外，D-阿洛酮糖對于植物的特殊作用，例如防蟲害等，如果在日后能夠研究徹底并制造出對人類和環境都有利的農業材料也將具有重大意義。“民以食為天,食以安為先”，在食品安全日漸突出的今天，低熱量、具備多種功能的食品會逐漸成為人們的主要食品。D-阿洛酮糖作為一種出色的功能性甜味劑，必定可以在未來的食品等行業發揮巨大作用，為改善人民生活水平做出貢獻。