電導率法篩選鎘離子印跡聚合物功能單體

于勁松， 徐 斐， 曹 慧， 袁 敏， 葉 泰， 塔瑪夏·提樂努爾，楊 曄， 楊洪志， 王首豐， 張港嘉

上海理工大學醫療器械與食品學院， 上海 200093

近年來，隨著環境污染的惡化，重金屬鎘在食品中污染問題越來越嚴重[1-3]。目前食品中鎘污染嚴重主要是由于用含鎘污水灌溉農田，間接地危及了水生生物與人類安全。鎘在人體內主要積聚在肝、腎和內分泌腺中，代謝和被清除的速度緩慢。我國國家標準GB 2762——2005《食品中污染物限量》規定了大米、大豆中鎘的限量≤0.2 mg/kg，花生≤0.5 mg/kg，面粉、雜糧等≤0.1 mg/kg；畜禽肉類≤0.1 mg/kg，肝臟≤0.5 mg/kg，而腎臟≤1.0 mg/kg[4]。

以分子印跡技術為基礎發展起來的離子印跡聚合技術，為當前重金屬特異性結合材料的探索帶來了新思路，通過該技術可以制備一種空間結構和結合位點與特定目標離子互補并匹配的聚合物[5-12]。分子印跡技術中，功能單體的選擇是很重要的一個步驟，選擇的功能單體需要與模板分子結合形成穩定的復合物，這樣制備出來的印跡聚合物(MIP)上可以形成功能單體與模板分子相匹配的印跡空穴，因此在制備Cd(II)離子印跡聚合物的過程中，需要篩選出與Cd(II)結合效果最好的功能單體[13-24]。針對篩選對象，提出采用電導法用于離子印跡聚合物功能單體篩選。電導法就是依靠物質電導率這一特性用來篩選分子印跡聚合物功能單體的方法，電導率是溶質溶解在某一溶劑里的導電性能，電導率越大，導電性能越良好，對于電導率而言，影響其大小的因素主要是溫度，溶液中溶質種類。濃度相同的不同物質在相同溫度下，其電導率是不同的。試驗中，我們假設篩選的配體在溶液中與鎘發生結合，生成的物質的導電性與配體和鎘都會有所差別，因此可以通過反應前后電導率的變化情況去判斷配體是否與鎘發生反應，以及不同配體與鎘反應的強弱。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

(1) 氨基酸類：包括半胱氨酸(Cys)、天冬氨酸(Asp)、甘氨酸(Gly)等在內的具有水溶性的17種氨基酸、谷胱甘肽(GSH)(優級純)。

(2) 核苷酸：8種核苷酸：腺嘌呤脫氧核苷酸(dAMP)，鳥嘌呤脫氧核苷酸(dGMP)，胞嘧啶脫氧核苷酸(dCMP)，胸腺嘧啶脫氧核苷酸(dTMP)，腺嘌呤核糖核苷酸(AMP)，胞嘧啶核糖核苷酸(CMP)，鳥嘌呤核糖核苷酸(GMP)，尿嘧啶核糖核苷酸(UMP)，核苷：胞苷、尿苷、腺苷、d胸苷等。

(3)二硫蘇糖醇(DTT)、磷酸鹽：焦磷酸鈉、十二水磷酸氫二鈉、葡萄糖-6-磷酸鈉、無水磷酸鈉；HEPES(4-羥乙基哌嗪乙磺酸)緩沖液，氫氧化鈉，鹽酸等。

1.2 儀器與設備

低溫恒溫循環器、恒溫震蕩儀、磁力攪拌器、LXJ-IIB離心機、電導率儀、pH計。

1.3 實驗方法

1.3.1緩沖液、單體、模板溶液的配置

本研究選用的緩沖液是非離子緩沖液HEPES，選用非離子型緩沖液可以減少實驗過程中緩沖背景對電導率測試的干擾；配置了不同pH的HEPES的緩沖液：6.8、7.15、7.5、7.85、8.2。單體母液的配置濃度為10 mmol/L(HEPES配置)；模板選用的是氯化鎘，模板的母液濃度為0.1 mol/L。

為了測量功能單體和隔離子結合的電導率變化，需要比較不同濃度下，結合后的功能單體和鎘離子的緩沖液體系與未結合的功能單體和鎘離子的緩沖液體系的電導率的差值。這里定義并配制了A、B、C、D四種溶液，A是僅含有鎘離子的緩沖液；B是僅含有功能單體的緩沖液，C是含有功能單體和鎘離子的緩沖液體系，D是HEPES緩沖液。其中B和C兩種溶液，B1～B4中單體的濃度為1 mmol/L、2 mmol/L、3 mmol/L、4 mmol/L，C1～C4中鎘離子的濃度為1 mmol/L，功能單體的濃度為1 mmol/L、2 mmol/L、3 mmol/L、4 mmol/L。

1.3.2電導率差值的定義

為了更好地處理實驗數據與分析結果，研究中定義了一個電導率差值的物理量。假設篩選的單體在溶液中與鎘發生結合，生成的物質的電導率與單體以及鎘溶液的電導率之和會有所差別。

電導率差值：Δσ=A-D+(B-D)-(C-D)=A+B-C-D。

公式中，A值代表氯化鎘緩沖液的電導率，B值單體緩沖液的電導率，C值單體和氯化鎘經一定比例混合后的電導率，D值是緩沖液的電導率。A～D：氯化鎘加入到緩沖液后體系電導率變化量，B～D：單體加入到緩沖液后體系電導率變化量，C～D：氯化鎘和單體同時加入到緩沖液后體系電導率變化量。電導率差值(Δσ)反映的是功能單體與鎘結合強弱，Δσ越大表明該功能單體與重金屬鎘離子的結合能力越強。

2 結果與討論

2.1 氨基酸作為功能單體與鎘結合前后的電導率測試研究

研究中，共考察了17種氨基酸作為功能單體時，與鎘結合前后的電導率變化，試驗結果如下圖所示：

圖1 氨基酸與鎘的結合篩選結果

由圖1可見，17中氨基酸中半胱氨酸的Δσ最高，在100到110之間；天冬氨酸、天冬酰胺以及谷氨酸的電導率差值位于第二梯隊，大約在15到30之間；其它氨基酸的電導率差值都在15以下，說明它們與鎘的結合能力較弱。除了半胱氨酸以外，其他氨基酸的電導率差值都隨單體濃度增高而升高。從結構上看，這17種氨基酸可以分為兩類：含巰基和不含巰基，其中含有巰基的只有半胱氨酸一種，而它的Δσ也遠遠高于其他的16種氨基酸。在Dokmanic等人的研究中也發現了類似的現象，他們從PDB數據庫里選了大約10 000種蛋白質與金屬離子結合，結果發現 Cd 與氨基酸形成的結合物 35%以上的配位數(CN，coordination number)為 4，而當配位數為4時，鎘離子傾向于和巰基中的硫結合。說明巰基可能在鎘離子和氨基酸結合的過程中起到很重要的作用。為了驗證這個觀點我們又設計另一組試驗來研究影響半胱氨酸與鎘離子結合性能的主要基團。

不含巰基的氨基酸中，天冬氨酸結構中相比較其它的氨基酸，多了一個羧基-COOH，天冬氨酸σ值高于其它氨基酸，推測-COOH對試驗的影響比較大。

2.2 影響半胱氨酸與鎘離子結合性能的主要基團

在上組試驗中我們發現了半胱氨酸與鎘離子有較好的結合性，我們推測可能是巰基在半胱氨酸與鎘離子結合過程中起到了主要作用。為了驗證這個觀點，我們分別選用了二硫蘇糖醇(DTT),半胱氨酸(Cys)和谷胱甘肽(GSH)三種含巰基的單體。按照之前的試驗步驟，分別研究這三種單體與1 mmol/L ～4 mmol/L這四種濃度的鎘離子單體結合后的電導率變化。其結果如圖2所示。

圖2 三種含巰基單體與鎘的結合特性

圖中的三條曲線分別是二硫蘇糖醇，半胱氨酸和和谷胱甘肽與鎘離子結合的電導率變化趨勢。它們的電導率差值都很大，在95～110之間，這充分說明了含巰基的單體與鎘離子有較好的結合率。其中谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸組成的三肽，它和鎘離子結合后的電導率差值很高，而谷氨酸，甘氨酸與鎘離子結合的電導率差值都很低，這反應了與鎘離子有良好結合性能的應該是半胱氨酸含有的基團。二硫蘇糖醇含有兩個巰基，其電導率的差值也比半胱氨酸和和谷胱甘肽要高(高了大約5左右)，這也說明巰基確實有較好的與鎘離子結合的能力。以上的試驗結果符合經典的軟硬酸堿理論：按照該理論對物質進行的劃分，鎘離子屬于軟酸，含巰基物質屬于軟堿，軟酸傾向于和軟堿結合。因此，含巰基的半胱氨酸、谷胱甘肽和二硫蘇糖醇等具有較強的與鎘離子結合的能力。

綜上，氨基酸的篩選試驗結果表明，-SH使得氨基酸與Cd(II)的結合能力更強，所以半胱氨酸的試驗效果最好，因此在氨基酸篩選試驗中，我們選擇半胱氨酸作為后面的待篩功能單體。

2.3 核苷酸作為功能單體與鎘結合前后的電導率測試研究

在篩選核苷酸與鎘結合能力的實驗中，我們選取了8種核苷酸作為我們的實驗單體。試驗結果如圖3所示：

圖3 核苷酸與鎘結合前后的電導率差值

從圖中可以看出dGMP和GMP與鎘離子結合的產生的電導率差值最高，數值在60到105之間，其次是腺苷酸和尿苷酸，數值在60到90之間，剩余的四種核苷酸電導率的差值基本相近在20到60之間。與17種氨基酸比較，核苷酸的電導率差值普遍較高，可見核苷酸是一種優異的金屬離子配體，有很好的配位性能。與氨基酸不同的是，核苷酸的結合能力差距并沒有這么明顯。

2.4 影響核苷酸與鎘離子結合性能的主要基團

為了進一步研究核苷酸與鎘離子的結合性能，我們選擇從核苷酸的組成入手分析。核苷酸的結構包含了磷酸，戊糖和堿基三個部分，通過將磷酸鹽附在核苷的糖環5，上，就會形成核苷酸。而這些磷酸鹽數量從一個到三個不等，本試驗選取的都是含有一個磷酸的核苷酸。

研究過程中共選擇了四種磷酸鹽：焦磷酸鈉、無水磷酸三鈉、磷酸氫二鈉(12水)、葡萄糖-6-磷酸鈉，考察它們與鎘離子的結合情況，其結果如圖3所示。

圖4 磷酸鹽與鎘結合電導率差值變化

從圖中可以看出，含有兩個磷酸基團的焦磷酸鈉電導率差值最大，在150到170之間，其次的是無水磷酸三鈉和十二水磷酸氫二鈉，電導率差值在60到120之間，最低的是葡萄糖-6-磷酸鈉，電導率差值在20到60之間。總體上，含磷酸物質與鎘離子的結合能力都很好，且含有的磷酸基團越多，與鎘離子結合性能越好。而R基的不同，也會影響與鎘離子的結合性能。這個試驗也可以證明磷酸基團確實與鎘離子有很好的結合能力。

核苷酸的結構中還有核苷，在篩選核苷與鎘結合能力的實驗中，我們選取了4種核苷作為我們的實驗單體，依次為胞苷、尿苷、腺苷與脫氧胸苷，其他幾種核苷難溶于水，因此暫且考察了4種核苷。試驗結果如圖5所示，結果顯示：四種核苷的電導率差值都很低，可見它們與鎘的結合能力都非常弱，幾乎可以忽略不計。

圖5 四種核苷與鎘結合前后的電導率差值

綜合圖3，圖4和圖5的試驗結果進行分析，可以確定的是：八種核苷單磷酸結構中的磷酸基團是可以與鎘發生較強親和的部位(圖4)；但核苷酸與金屬離子鎘的結合能力又是有大有小的(圖3)，可見磷酸并不是唯一的親合部位。可以推測，核苷酸中的堿基部分理應與鎘離子有親和作用。但圖5的實驗結果又是與推測矛盾的。可以給一個這樣的解釋：單獨的堿基與鎘離子不能發生親合，它與鎘離子產生親合是需要條件的，需借助磷酸基團的存在時才可體現出來。磷酸基團起的作用像是打開堿基與鎘親和力的開關，或者類似一個“催化劑”的作用一樣。

2.5 功能單體與鎘離子結合所需pH的優化分析

研究中考察了本實驗中緩沖液的最適pH, HEPES緩沖液的緩沖范圍是6.8～8.2，我們在這個范圍中進行了多次實驗，并用了之前實驗的大部分單體來進行實驗，以找到最適用于試驗的pH。從實驗結果中我們可以發現，所有單體在pH 6.8到8.2的范圍內的電導率差值都是先上升再下降，在緩沖液pH 7.5時，單體的電導率差值最高，并且幾乎所有單體都呈現此種趨勢，因此可選擇7.5作為最優的單體與鎘結合的pH條件。

圖6 單體與鎘結合后電導率差值與pH的關系

3 結論

離子印跡技術作為新興的特異性檢測和去除重金屬離子的技術，目前面臨的主要難點在于功能單體的選擇，常用的幾種分子印跡聚合物都無法很好與重金屬離子特異性的結合，而國內外關于相關功能單體的研究還比較少。本文通過研究鎘離子與功能單體的結合，希望給之后的功能單體選擇研究提供一些幫助。通過實驗得到的主要結論是：(1) 鎘離子是一種軟酸，巰基是一種弱堿，根據軟硬酸堿理論，軟酸易于軟堿發生反應。所以鎘離子與巰基有很好的結合性能；(2) 磷酸根帶有很多的負電荷，易于含有正電荷的鎘離子通過靜電作用結合；(3) 在此過程中還優化了緩沖液的pH，通過實驗發現緩沖液在 pH為7.5時為最優。

雖然通過電導率法篩選與鎘結合的功能單體簡單又方便，但是這種方法依然存在著很多不可忽視的問題：(1) 在實驗中測出某些單體電導率差值為負數，還未能找出合理的原因來解釋此種問題；(2) 由于時間有限，現在篩選的功能單體較少，可能存在其他與鎘有更好結合能力的功能單體。