攪拌槳組合對土壤桿菌產可得然膠的影響

萬 婕， 王貽峰， 高紅亮， 解秀娟， 楊雪霞*

1.東華大學 化學化工與生物工程學院, 上海 201620; 2.華東師范大學 生命科學學院, 上海 200241;3.上海東圣生物科技有限公司, 上海 201609

可得然膠主要是由土壤桿菌屬(Agrobacterium)的細菌在氮源不足、碳源過量的條件下產生的一種水不溶性β-D-1,3-葡聚糖。該多糖具有獨特的熱凝膠性和良好的生物活性，在食品、醫藥、生物材料等領域受到了廣泛的關注[1-3]。為提高可得然膠產量，降低可得然膠生產成本，研究者在可得然膠菌株選育、培養基及培養條件優化等方面做了大量的工作。KIM等通過菌株誘變及培養條件優化，突變菌株的可得然膠產量比出發菌株提高18.8%[4]。LEE等通過優化培養基碳源，可得然膠產量達到60 g/L[5]。ZHENG等通過調整培養基碳氮比及補料發酵工藝優化，可得然膠產量達到67 g/L[6]。

作為水不溶性胞外多糖，合成的可得然膠包裹著細胞，影響氧氣從發酵液進入細胞，因此在可得然膠發酵中，隨著可得然膠合成量增加，易造成氧傳遞困難，制約可得然膠產量的進一步提高。通過提高攪拌轉速可以促進傳質，但該方法不僅增加能耗，而且易引起菌體代謝異常、產品質量下降。攪拌槳是生物反應器的重要組成部分，通過改變反應器的攪拌槳及其組合，可以優化傳質，提高發酵效果。LAWFORD等使用軸流式攪拌槳代替徑流式攪拌槳提高了可得然膠的質量，進一步結合通入富氧空氣提高了可得然膠產量[7,8]。孫京云等探究了在可得然膠連續流加葡萄糖發酵工藝中兩種攪拌槳組合(三層槳均為六平葉徑流槳3RT和底層槳為六平葉輪徑流槳、上層槳為橢圓槳RT+E)對發酵的影響，發現兩種攪拌槳引起的溶氧變化不同，3RT組合時溶氧好于RT+E組合，但RT+E組合能更好促進發酵液內部的混合，導致可得然膠產量略有提高[9]。目前關于攪拌槳組合對可得然膠發酵影響的研究較少。另外，作為一種均一葡聚糖，可得然膠分子大小對其特性及應用影響顯著，目前研究很少關注攪拌槳組合對發酵產生的可得然膠分子量的影響。

本文以土壤桿菌(Agrobacteriumsp.)761031-45A為對象，考察了六種攪拌槳組合對可得然膠發酵和分子量的影響，為可得然膠的工業化生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

(1) 菌株

土壤桿菌(Agrobacteriumsp.)761031-45A，本實驗室保藏。

(2) 培養基

種子培養基(g/L)：蔗糖20.0，KH2PO41.5，(NH4)2HPO45.0，MgSO4·7H2O 1.0，CaCO33.0，調pH至7.0。

發酵培養基(g/L)：蔗糖100.0，KH2PO42.0，(NH4)2HPO43.0，MgSO4·7H2O 1.0，酵母粉4.5，CaCO32.0，消泡劑0.5，調pH至7.0。

上述培養基滅菌方式均為121 ℃，20 min。

(3) 攪拌槳類型及其組合方式

實驗選用六直葉圓盤槳(DT)、非對稱拋物線圓盤槳(BT-6)、六箭葉圓盤槳(ADT)、六斜葉圓盤槳(PDT)和半圓管圓盤槳(CD)五種攪拌槳的六種組合。六種組合中，下層槳均采用六直葉圓盤槳，上層槳和中層槳組合見圖1。攪拌槳組合1#為DT+PDT，攪拌槳組合2#為BT-6+PDT，攪拌槳組合3#為BT-6+BT-6，攪拌槳組合4#為PDT+ADT，攪拌槳組合5#為CD+CD，攪拌槳組合6#為BT-6+ADT。

圖1 六種攪拌槳組合的上層槳和中層槳

1.2 實驗方法

(1) 培養方法

種子培養：斜面保藏的菌種取2環菌苔于種子培養基(50 mL/250 mL三角瓶)，250 r/min，30 ℃搖床振蕩培養14 h。

發酵培養：10 L發酵罐(T&J QType，上海迪必爾生物工程有限公司)裝液量6 L，接種量為5%(v/v)，通氣量為1 vvm，攪拌轉速為500 r/min(0 h～12 h)、700 r/min(12 h～36 h)、800 r/min(36 h～72 h)，30 ℃培養。考慮到取樣和水份蒸發，在發酵36 h和48 h時分別補水0.5 L，維持發酵體積。

(2) 可得然膠產量和菌體干重測定

按照KALYANASUNDARAM等的方法進行測定[10]。

(3) 蔗糖含量的測定

3,5-二硝基水楊酸(dinitrosalisylic acid，DNS) 比色法[11]。

(4) 氨態氮含量測定

水楊酸鈉-次氯酸鈉比色法[12]。

(5) 發酵液粘度測定

取發酵液，選取相應轉子，用粘度計NDJ-5S(上海昌吉地質儀器有限公司)進行測量。

(6) 體積溶解氧系數KLa測定

采用亞硫酸鹽法測定KLa。在攪拌轉速為500 r/min、通氣量為1vvm條件下測定不同攪拌槳組合時的KLa[13]。

(7) 可得然膠分子量測定

分子量測定采用凝膠滲透色譜法(GPCmax VE-2001，Malvern，UK)。可得然膠溶解在DMSO中(終濃度為0.3 mg/mL)，并以DMSO為流動相，流速為0.5 mL/min，在配備有I-MBHMW-3078極性有機柱(300 mm×7.8 mm，CLM1013，Malvern)的Viscotek RImax系統上進行測定。

2 結果與討論

攪拌是影響發酵效果的主要因素之一，不同類型的攪拌槳在發酵罐中產生不同的流體形態、剪切力分布、氣含率分布等，進而影響微生物生長及產物合成。組合不同類型攪拌槳，發揮其各自優勢，能夠提高微生物發酵生產效率。實驗選用五種攪拌槳，采用六種組合，考察不同攪拌槳組合對可得然膠發酵的影響。

2.1 攪拌槳組合對體積溶解氧系數的影響

實驗測定了不同攪拌槳組合下的KLa，結果見圖2。根據KLa值的大小，可以把攪拌槳組合分為3類，一類攪拌槳組合所得體積溶解氧系數低，如攪拌槳組合1#，KLa值為303.6 h-1；一類攪拌槳組合所得體積溶解氧系數中等，如攪拌槳組合4#，KLa值為428.6 h-1；一類攪拌槳組合所得體積溶解氧系數較高，如組合2#、3#、5#和6#，KLa值大于500.0 h-1，其中組合6#的體積溶解氧系數最高，為547.6 h-1。可見攪拌槳組合對發酵罐中氧傳遞速率影響顯著。組合1#和組合2#的區別只在于上層槳不同，組合1#上層槳為DT，組合2#上層槳為 BT-6，組合2#氧傳遞效果好于組合1#。組合4#和組合6#的區別也只有上層槳不同，組合4#上層槳為PDT，組合6#上層槳為BT-6，組合6#氧傳遞效果好于組合4#。BT-6 攪拌器的特點是采用了上下不對稱的結構設計, 有助于捕獲和分散氣體，氣液傳質系數高[14,15]，故上層槳為BT-6的組合2#、組合6#和組合3#發酵體系溶解氧系數高。CD槳與BT-6槳均為彎葉槳，在傳質方面有類似之處，故上層槳和下層槳均為CD槳的組合5#發酵體系的溶解氧系數也較好。

圖2 不同攪拌槳組合下的體積溶解氧系數

2.2 攪拌槳組合對可得然膠發酵的影響

可得然膠發酵過程中發酵體系溶解氧變化如圖3所示，不同攪拌槳組合時發酵體系溶解氧變化規律相似，主要分為四個階段。在0 h～12 h區間，體系溶解氧迅速降低，這主要歸結為接種后，菌體生長迅速，對氧的需求量大。在12 h～18 h區間，溶解氧逐步回升，此時菌體開始進入產膠期，對氧的需求降低。在18 h～54 h區間，溶解氧不斷降低，除攪拌槳組合5#，其余組合均出現溶解氧為零，其中36 h和48 h 處的溶解氧稍有回升主要是此時補水導致。54 h之后，發酵體系溶解氧開始回升。從溶解氧水平看，攪拌槳組合為5#時體系的溶解氧水平高于其它攪拌槳組合，在整個發酵過程中溶解氧均在30%以上。攪拌槳組合3#發酵體系中溶氧水平僅次于攪拌槳組合5#。攪拌槳組合為1#時體系的溶解氧水平最低。

圖3 攪拌槳組合對可得然膠發酵體系溶解氧的影響

六種攪拌槳組合對可得然膠產量的影響如圖4A所示。0 h～12 h為菌體生長階段，此時無可得然膠產生；12 h后進入可得然膠合成階段，其中24 h～48 h為可得然膠快速合成期。攪拌槳組合5#所得可得然膠產量最高，其次為組合6#，產量分別達到58.2 g/L和56.7 g/L。組合1#產量最低，為42.9 g/L。

菌體干重變化見圖4B。0 h～24 h菌體干重快速增加，產膠期菌體干重穩定，發酵后期菌體干重略有下降，可能是部分菌體衰老裂解。攪拌槳組合5#所得菌體干重最大，其次為組合6#，菌體干重分別為4.2 g/L和3.9 g/L。攪拌槳組合1#所得菌體干重最低，為3.2 g/L。

發酵過程中蔗糖消耗變化如圖4C所示，0 h～48 h階段，蔗糖快速消耗，蔗糖含量從110 g/L左右降為15 g/L左右。72 h時，蔗糖基本利用完。攪拌槳組合1#消耗蔗糖速率最快，但菌體干重和可得然膠產量卻較低，說明該攪拌槳組合不適合菌體生長和可得然膠產生。

攪拌槳組合對發酵液pH的影響見圖4D。不同攪拌槳組合下發酵體系pH變化趨勢比較一致，0 h～12 h 期間pH由7不斷下降至pH 5.5左右。在12 h～48 h區間pH穩定在 5.5左右，此pH也是可得然膠合成的最適pH；48 h后pH不斷上升至6.0左右，這是可能是由于碳源耗盡，菌體進入衰亡期，細胞裂解物釋放導致pH升高。

注：攪拌槳組合1#★；2# □；3# ▲；4# ▽；5# ■；6# ○圖4 不同攪拌槳組合時可得然膠合成代謝曲線

不同攪拌槳組合時，可得然膠得率及生產強度見表1。可得然膠的得率和可得然膠的產量有相同的趨勢。攪拌槳組合5#和6#獲得最大得率和生產強度，得率分別為0.55 g/g蔗糖和0.53 g/g蔗糖，生產強度分別為0.81 g/L/h和0.79 g/L/h。組合1#可得然膠得率和生產強度最低，分別為0.42 g/g蔗糖、0.60 g/L/h。這表明使用攪拌槳組合5#或6#可得然膠發酵效果最好，使用組合1#可得然膠發酵效果較差。

發酵液粘度變化如圖5所示，在0 h～24 h間，發酵液粘度變化不大，此階段主要是菌體生長，合成的可得然膠較少。在24 h～48 h間，發酵液粘度隨發酵時間延長快速增加，此階段為可得然膠快速合成期，可得然膠產量的增加使得發酵體系粘度增加。48 h后，發酵體系粘度增加緩慢。對比六種攪拌槳組合體系的發酵液粘度發現，攪拌槳組合5#所得發酵液粘度最低，48 h時發酵液粘度為1 290 mPa·s；其次是攪拌槳組合6#，48 h時發酵液粘度為2 200 mPa·s；其它攪拌槳組合所得發酵液粘度均較高，在(2 500～3 000) mPa·s之間，相互間差異不顯著。有研究表明粘度是影響KLa的最主要因素之一，隨著粘度增加KLa迅速減小[9]。可得然膠發酵中，不同攪拌槳組合可能造成微生物代謝差異，導致發酵液粘度不同，影響發酵體系溶解氧水平，最終影響產物合成。

表1 攪拌槳組合對可得然膠得率和生產強度的影響

注：同行小寫字母不同表示組間存在顯著性差異(P<0.05)

圖5 攪拌槳組合對可得然膠發酵體系粘度的影響

綜上所述，攪拌槳組合5#的發酵體系溶解氧較好，無論菌體生長期還是產膠期，發酵體系溶解氧均能滿足要求，有利于菌體增殖和可得然膠合成，體系粘度較低。5#攪拌槳組合上層和中層均采用半圓管圓盤漿，這種槳型較一般的直葉槳型載氣量提高，改善了傳質和分散能力，用作氣體的分散特別有效，且剪切小，這樣既能保證發酵時的溶氧供給，又減少了對菌體的剪切影響[16,17]。攪拌槳組合1#最不適合菌體生長和可得然膠合成，其原因可能是上層直葉槳剪切力過強，對菌體生長及產物合成造成不利的影響。

2.3 攪拌槳組合對可得然膠相對分子量的影響

可得然膠為大分子多糖，其相對分子量在5.3×104～2.0×106之間[18]。SAIT等[19]研究表明，發酵過程中培養基的營養狀況、溶解氧等條件都會影響可得然膠的聚合度，從而影響可得然膠的品質。不同攪拌槳組合所得可得然膠的相對分子量如圖6所示，菌株761031-45A所產可得然膠相對分子量在1.1×106以上。在不同攪拌槳組合下，在發酵后期(48 h～72 h)，可得然膠相對分子量均隨發酵時間延長而降低，這可能是因為發酵后期細胞衰老，發酵體系傳質效果降低，部分菌體裂解，釋放的酶導致可得然膠分子水解[20]。攪拌槳組合為5#和3#時，相對分子量下降相對緩慢，在72 h時相對分子量分別為1.50×106和1.46×106。相對分子量降低最快的是攪拌槳組合2#，發酵36 h時的相對分子量為1.88×106，72 h時降為1.14×106。

圖6 攪拌槳組合對可得然膠分子量的影響

3.4 結論

在6種攪拌槳組合中， 5#攪拌槳組合(半圓管圓盤槳+半圓管圓盤槳+六直葉圓盤槳)更適合可得然膠發酵，所得可得然膠產量、得率及生產強度最高，分別為58.2 g/L、0.55 g/g蔗糖和0.81 g/L/h，其次為6#組合。不同攪拌槳組合對發酵體系pH變化和蔗糖消耗影響一致。使用5#攪拌槳組合時，在整個發酵過程中溶解氧均在30%以上，發酵體系的粘度低于其它攪拌槳組合體系，所得可得然膠分子量相對穩定。通過選擇合適的攪拌槳可以提高可得然膠產量和特性。