荷葉堿對非酒精性脂肪肝模型小鼠肝組織中SREBP信號通路的影響

何 冰，高雁鴻，孫 華，王俊玲

（曲靖市第一人民醫院，曲靖 655000）

非酒精性脂肪肝（NAFLD）是一種以肝臟中脂肪過度堆積引發肝細胞變性為特征的慢性肝病，且患者無過量飲酒史[1]。NAFLD可引發許多疾病如肝硬化[2]、冠心病[3]、糖尿病[4]等。近些年，NAFLD 在中國的發病率持續增高[5]。荷葉堿是中藥荷葉中的主要成分，對肥胖及胰島素抵抗有一定的療效[6-7]。本實驗通過蛋氨酸和胱氨酸聯合缺乏飼料建立NAFLD小鼠模型，考察荷葉堿對NAFLD的治療作用，并檢測小鼠肝組織中膽固醇調節元件結合蛋白（SREBP）相關通路mRNA表達，進一步探討荷葉堿對NAFLD的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 成年雄性C57BL/6小鼠60只，體質量（20±2）g，由北京華阜康生物科技有限公司提供。動物合格證號：1103221800000880。小鼠飼養于SPF級清潔環境中，標準飼料喂養，自由進食，室溫（22±2）℃。

1.2 主要試劑及儀器 荷葉堿標準品（C19H21NO2，純度≥98%）購自維克奇生物科技有限公司；二甲雙胍、油紅O染色試劑盒購自索萊寶生物科技有限公司；蛋氨酸和胱氨酸聯合缺乏飼料購自斯貝福生物技術有限公司；血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、總膽固醇（TC）試劑盒、三酰甘油（TG）試劑盒購自南京建成生物科技有限公司；核糖核酸（RNA）提取、反轉錄、擴增試劑盒購自天根生物科技有限公司；多功能讀扳機（Thermo）；光學顯微鏡（Nikon ECLIPSE TS100）；熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）儀（Bio-RAD iQTM5）。

1.3 NAFLD模型建立及分組 NAFLD模型建立采用蛋氨酸和胱氨酸聯合缺乏飼料喂養12周[7]。將60只小鼠隨機分為6組：正常組、模型組、二甲雙胍組、荷葉堿低劑量組、荷葉堿中劑量組和荷葉堿高劑量組，每組10只。除正常組每天灌胃生理鹽水外，其余各組均建立NAFLD模型。造模4周后，模型組及荷葉堿低、中、高劑量組每天分別灌胃生理鹽水、荷葉堿7.5、15、30 mg/kg，連續灌胃 8 周，二甲雙胍組每天灌胃二甲雙胍90 mg/kg，連續灌胃8周。

1.4 觀察指標及檢測方法

1.4.1 小鼠血脂及肝功能 造模給藥后收集各組小鼠血清，檢測各組小鼠血清中ALT、AST、TC及TG含量。

1.4.2 小鼠肝組織染色 造模給藥后，收集各組小鼠肝組織，用福爾馬林溶液固定，對各組小鼠肝組織進行蘇木精-伊紅（HE）染色觀察肝組織病理學變化。同時對各組小鼠肝組織進行油紅O染色觀察肝組織中脂質含量。

1.4.3 熒光定量PCR檢測 造模給藥后，提取各組小鼠肝組織中總RNA，反轉錄合成cDNA，采用SYBR Green Real Time RT-PCR試劑盒進行擴增，檢測各組小鼠肝組織中SREBP通路相關基因SREBF-1、乙酰CoA羧化酶（ACC）、ATP-檸檬酸裂解酶（ACLY）及脂肪酸合酶（FASN）基因表達，采用β-肌動蛋白（β-actin）為內參，具體引物序列見表1。

表1 引物序列

1.5 統計學處理 采用SPSS 23.0統計軟件進行統計分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 荷葉堿對NAFLD模型小鼠的治療作用 造模給藥結束后，與正常組相比，模型組、二甲雙胍組、荷葉堿低、中、高劑量組小鼠體質量顯著增高（P＜0.05），血清中ALT、AST、TG 及 TC 水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，二甲雙胍組、荷葉堿中、高劑量組小鼠體質量顯著降低（P＜0.05）；此外與模型組相比，二甲雙胍組、荷葉堿低、中、高劑量組血清中ALT、AST、TG 及 TC 水平顯著降低（P＜0.05），見表 2。通過HE染色結果發現，模型組小鼠肝組織中肝細胞出現明顯脂肪變性，二甲雙胍及荷葉堿各劑量組對NAFLD模型小鼠肝組織中脂肪變性都有所緩解，見圖1。此外油紅O染色同樣表明與正常組相比，模型組小鼠肝組織中脂質增多，與模型組相比，二甲雙胍及荷葉堿各劑量組小鼠肝臟中脂質有所減少，見圖2。

2.2 荷葉堿對NAFLD模型小鼠肝組織中SREBP信號通路相關基因表達的影響 與正常組相比，模型組小鼠肝組織中SREBF-1、ACC、ACLY及FASN mRNA表達顯著上調（P＜0.05）；與模型組相比，二甲雙胍組、荷葉堿中、高劑量組小鼠肝臟中SREBF-1、ACC、ACLY及FASN mRNA表達顯著下調（P＜0.05）；此外與模型組相比，荷葉堿低劑量組小鼠肝組織中ACC、ACLY及FASN mRNA表達顯著下調（P＜0.05），見圖3。

3 討論

本研究通過蛋氨酸和胱氨酸聯合缺乏飼料建立NAFLD小鼠模型，蛋氨酸和胱氨酸聯合缺乏飼料是一種常用的建立NAFLD模型的飼料，經過12周的蛋氨酸和胱氨酸聯合缺乏飼料飼養，模型組小鼠體質量、血脂及血清肝功能相關生化指標顯著升高，模型組小鼠肝細胞中出現明顯的脂肪變性及脂質過度堆積，這些結果與NAFLD的模型判定標準一致，提示造模成功[8]。荷葉苦、平，歸肝、脾、胃經，始載于唐朝孟詵《食療本草》，歷版《中國藥典》亦均有收載，具有清熱解暑、升發清陽、涼血止血之功效。作為一味傳統中藥，荷葉在減肥降脂方面的保健和治療效果突出[9-10]，現代研究證明其主要成分荷葉堿能通過調節能量代謝紊亂及機體脂質代謝，并緩解脂質過氧化損傷和氧化應激，從而抑制脂肪細胞分化和胰脂肪酶活性，其中抑制作用最強的是芐基異喹啉生物堿，在抑制脂肪積累的同時，還能有效減少機體對脂肪吸收[11-12]。本實驗結果顯示，荷葉堿可顯著降低NAFLD模型小鼠體質量、血脂及肝組織中脂肪變性及脂質堆積，此外荷葉堿還可顯著緩解NAFLD小鼠血清肝生化指標水平，這些結果表明荷葉堿對NAFLD具有良好的治療作用。

表2 造模給藥后各組小鼠體質量及血清生化指標水平（±s）

表2 造模給藥后各組小鼠體質量及血清生化指標水平（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

ALT（U/L） AST（U/L） TG（mmol/L） TC（mmol/L）正常組 24.18±4.91 25.34± 5.96 0.66±0.08 0.79±0.15模型組 77.47±9.15* 103.27±15.88* 1.75±0.39* 1.88±0.40*二甲雙胍組 46.82±5.89*# 77.40±15.21*# 0.89±0.11*# 0.97±0.16*#荷葉堿低劑量組 57.69±3.14*# 88.74± 9.03*# 1.12±0.28*# 1.31±0.17*#荷葉堿中劑量組 50.17±3.15*# 80.05± 5.28*# 0.92±0.30*# 1.29±0.15*#荷葉堿高劑量組 47.77±3.59*# 70.34±11.50*# 0.96±0.18*# 1.18±0.26*#組別n 10 10 10 10 10 10體質量（g）24.2±1.8 36.5±5.7*30.2±2.8*#33.9±8.7*31.6±3.9*#30.5±2.4*#

圖1 造模給藥后各組小鼠肝組織HE染色（n=6，200×）

圖2 造模給藥后各組小鼠肝組織油紅O染色（n=6，200×）

圖3 造模給藥后各組小鼠肝組織中SREBP通路相關mRNA 表達水平（±s，n=6）

SREBP是調控細胞脂肪合成的重要轉錄因子[13-14]。當細胞攝入脂質增多時，SREBP發生裂解活化進入細胞核，調控脂肪代謝相關酶如ACLY、ACC及FASN表達，促進細胞脂質合成[15]。其中ACLY可將細胞中的檸檬酸轉化為乙酰輔酶A，乙酰輔酶A在ACC催化下進行羧化，進而形成丙二酰輔酶A，丙二酰輔酶A在FASN作用下最終轉化為脂肪酸。NAFLD小鼠肝細胞中SREBP及其下游因子表達顯著升高[16]，降低SREBP相關通路因子表達可緩解NAFLD[17]。本研究結果表明荷葉堿能顯著下調NAFLD模型小鼠SREBP相關通路mRNA表達，提示荷葉堿可能是通過抑制肝組織中SREBP信號通路激活發揮治療NAFLD的作用機制。

此外，本研究選用二甲雙胍作為陽性對照，且荷葉堿中劑量及高劑量組中相關NAFLD療效指標與二甲雙胍組無明顯差異，但是荷葉堿是否可以在治療NAFLD中作為二甲雙胍的替代藥物尚需要臨床進行驗證。