黃龍止咳口服液對(duì)咳嗽變異性哮喘模型小鼠的作用機(jī)制研究*

王春燕，隆紅艷

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，南京 210029；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京中醫(yī)院，南京 210023）

咳嗽變異性哮喘（CVA）又稱變異性哮喘、隱匿性哮喘，是引起中國(guó)兒童尤其是學(xué)齡前和學(xué)齡期兒童慢性咳嗽的最常見(jiàn)原因，臨床以咳嗽為唯一或主要表現(xiàn)[1]。CVA的發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前認(rèn)為是由多因素共同作用引起氣道慢性炎癥、氣道高反應(yīng)性和氣道重構(gòu)的結(jié)果，報(bào)道稱有超過(guò)30%的CVA患兒最終發(fā)展成典型哮喘[2]。目前的臨床診治方法與哮喘相似，多以吸入性糖皮質(zhì)激素、支氣管擴(kuò)張劑和白三烯受體拮抗劑為主，雖見(jiàn)效快，但長(zhǎng)期服用不良反應(yīng)大，停藥后易復(fù)發(fā)，加上低齡兒童對(duì)于吸入療法依從性差，導(dǎo)致治療效果不甚理想。本病中醫(yī)屬于“風(fēng)咳”范疇[3]，黃龍止咳口服液（HLOL）作為南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京中醫(yī)院治療兒童CVA的有效驗(yàn)方，多年來(lái)在臨床取得顯著的療效。前期的臨床研究已經(jīng)證實(shí)，在使用黃龍合劑1個(gè)療程（2周）后，患兒第1秒用力呼氣量（FEV1）、最大呼氣流量（PEF）有明顯改善，血中嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)和T淋巴細(xì)胞亞群CD4+、白細(xì)胞介素（IL）-4均顯著降低，進(jìn)而使支氣管痙攣得到有效緩解，減輕氣道炎癥，降低氣道高反應(yīng)性，顯著改善持續(xù)性咳嗽等臨床癥狀[4-5]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究也表明黃龍合劑可以有效降低氣道周圍炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度，減少氣道壁和血管周圍膠原沉積，抑制細(xì)胞炎癥因子的釋放，最終改善肺功能障礙和氣道重塑[6]。本研究觀察HLOL對(duì)CVA模型小鼠氣道炎癥及Toll樣受體（TLR）4/髓樣分化因子（MyD88）/核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）通路的影響，從而探討HLOL治療CVA的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠（18～22g），由南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)前在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室條件下飼養(yǎng)1周[許可證號(hào)：SYXK（蘇）2016-0018]。動(dòng)物的處理遵守國(guó)家健康協(xié)會(huì)制定的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南[7]。

1.1.2 藥物 HLOL由麻黃、地龍、苦杏仁、前胡、桑白皮、蟬蛻、紫蘇子、旋覆花共8味藥組成，其中前胡、桑白皮、紫蘇子使用醇提，其藥渣與剩余5味合并水煎。水煎液和醇提液混合并濃縮，得到生藥量1.5 g/mL，調(diào)整pH值，加防腐劑，靜置后取上清即得。地塞米松（Dex）（生產(chǎn)批號(hào)：CD170417b）。

1.1.3 主要試劑及儀器 卵蛋白（OVA）（批號(hào)：1002638270）、氫氧化鋁（批號(hào)：21645-51-2）、乙酰甲膽堿（Mch）購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司，白細(xì)胞介素（IL）-4、IL-5、IL-13酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒購(gòu)于 Elabscience 公司，TLR2、TLR4、MyD88、NF-κB p65抗體購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling公司。

O2AI超聲霧化器（江蘇魚(yú)躍醫(yī)療設(shè)備有限公司），超純水系統(tǒng)（美國(guó)Thermo公司LabTower），正置熒光顯微鏡（日本Olympus公司BX43），全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-TekEpoch），全自動(dòng)洗板機(jī)（美國(guó)Bio-Tek ELX50），蛋白成像系統(tǒng)（美國(guó) Bio-Rad ChemiDoc XRS+），小鼠無(wú)創(chuàng)肺功能儀（Buxco American）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 將50只雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為5組，分別為正常組、OVA組、Dex組、HLOL低劑量組、HLOL高劑量組，每組10只。

1.2.2 動(dòng)物模型建立 參照文獻(xiàn)方法建立模型[8-9]，采用OVA和氫氧化鋁激發(fā)致敏，并用OVA霧化激發(fā)來(lái)建立CVA模型小鼠。所有小鼠飼養(yǎng)1周，于第1、7、14 天，正常組小鼠每只腹腔注射 200 μL 生理鹽水，其他各組小鼠每只腹腔注射200 μL致敏液（含OVA 100 μg，氫氧化鋁 20 μg，溶解于生理鹽水溶液中）致敏。末次注射1周后，除正常組外其余各組均以1.5%OVA溶液進(jìn)行超聲霧化，每日30 min，連續(xù)激發(fā)14 d。每次激發(fā)前1 h，Dex組以Dex片配制成溶液后以2 mg/kg灌胃，HLOL低劑量組0.75 g/kg、高劑量組1.5 g/kg等劑量灌胃，正常組和模型組以等劑量生理鹽水灌胃。

1.2.3 標(biāo)本收集 在最后1次給藥激發(fā)后24 h測(cè)定部分小鼠的氣道反應(yīng)性，處死小鼠，摘眼球取血，12 000 r/min離心，離心半徑為21 cm，離心后取上層血清，置于-80℃凍存。打開(kāi)小鼠胸腔，取左側(cè)肺組織置于4%多聚甲醛溶液中固定，經(jīng)石蠟包埋、切片、染色，其余肺組織于-80℃凍存。

1.2.4 小鼠氣道反應(yīng)性測(cè)定 末次激發(fā)24 h后，Buxco無(wú)創(chuàng)肺功能儀檢測(cè)小鼠增強(qiáng)的呼吸間歇（Penh），首先測(cè)定小鼠基礎(chǔ)Penh值1 min，隨后測(cè)定倍增濃度Mch霧化激發(fā)后Penh的變化，每次霧化2 min，記錄3 min。Mch激發(fā)濃度由低到高，記錄各濃度Mch激發(fā)下的Penh值。

1.2.5 ELISA法測(cè)定小鼠血清中總免疫球蛋白E（IgE）及IL-4、IL-5、IL-13的含量 根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟，依次檢測(cè)血清中總IgE、IL-4、IL-5和IL-13的含量，并進(jìn)行分析。

1.2.6 肺組織學(xué)檢查 將固定后的左肺依次進(jìn)行脫水、浸蠟、包埋等步驟，并進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色。

1.2.7 免疫組化檢測(cè) 石蠟切片常規(guī)脫蠟、脫水，并置于100℃的抗體修復(fù)液中修復(fù)30 min，根據(jù)說(shuō)明書(shū)按比例制備兔抗鼠TLR4和磷酸化（p）-NF-κB p65抗體（1∶1 000），4℃孵育過(guò)夜，孵育二抗，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色、蘇木精復(fù)染，封片后觀察并拍照。

1.2.8 蛋白免疫印跡（Western blot）檢測(cè) 收集肺組織并裂解，二喹啉甲酸（BCA）法測(cè)定樣品蛋白濃度。每個(gè)泳道加等量的蛋白樣品分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，封閉后分別加入一抗（TLR4、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65）4 ℃過(guò)夜。二抗孵育后加入ECL熒光試劑，進(jìn)行圖像采集和數(shù)據(jù)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HLOL對(duì)各組小鼠肺組織病理學(xué)改變比較 相較于正常組，OVA組小鼠肺組織切片可見(jiàn)氣道平滑肌增厚，支氣管及血管周圍有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。經(jīng)Dex治療后仍有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，HLOL各組肺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，支氣管壁結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，減輕了OVA誘導(dǎo)的氣道炎癥。見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠肺組織病理切片（HE染色，200×）

2.2 HLOL減輕小鼠氣道高反應(yīng)性（AHR） 除正常組外，其余各組Penh值都有隨Mch升高而增加的趨勢(shì)。與正常組相比，OVA組的AHR顯著增加（P＜0.01），用藥治療后均能降低氣道Penh值（P＜0.01），因此，HLOL能有效降低CVA模型小鼠的AHR。見(jiàn)圖2。

圖2 各組小鼠 AHR（±s，n=10）

2.3 HLOL對(duì)小鼠血清細(xì)胞的影響 與正常組相比，OVA組小鼠血清中總細(xì)胞數(shù)與嗜酸性粒細(xì)胞（EOS）、淋巴細(xì)胞（LYM）和中性粒細(xì)胞（NEU）的細(xì)胞數(shù)較正常組明顯升高（P＜0.01）。與OVA組相比，HLOL各組的總細(xì)胞數(shù)與EOS、LYM、NEU均明顯減少（P＜0.01），Dex組減少更為明顯。見(jiàn)圖3。

圖3 各組小鼠血清總細(xì)胞和各炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)（±s，n=10）

2.4 HLOL可降低血清總IgE和炎癥因子IL-4、IL-5、IL-13的水平 與正常組比較，OVA組血清中IgE 和 IL-4、IL-5、IL-13含量明顯增高（P＜0.01）；與OVA組比較，各治療組IgE和炎癥因子均明顯降低（P＜0.01），提示各治療組均對(duì)CVA有一定的治療作用。相較于HLOL低劑量組，高劑量組的作用更明顯。見(jiàn)圖4。

圖4 ELISA法測(cè)定各組小鼠總IgE和IL-4、IL-5、IL-13 水平（±s，n=10）

2.5 HLOL對(duì)肺組織中TLR4/NF-κB信號(hào)通路的影響 OVA組小鼠肺組織中TLR4、MyD88和p-NF-κB p65的蛋白表達(dá)明顯高于正常組（P＜0.01），經(jīng)治療后各蛋白含量明顯降低（P＜0.01），表明HLOL可以抑制TLR4、MyD88和p-NF-κB p65蛋白的表達(dá)。見(jiàn)圖5。

免疫組化可見(jiàn)經(jīng)OVA刺激后氣道周圍TLR4和p-NF-κB P65蛋白明顯聚集，而HLOL各組較OVA組蛋白水平均有不同程度的減弱。見(jiàn)圖6。由此可見(jiàn)，HLOL減弱OVA誘導(dǎo)的過(guò)敏氣道炎癥可能與TLR4/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。

3 討論

CVA是一種過(guò)敏性氣道炎癥性疾病，以氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性和氣道重塑為主要病理基礎(chǔ)，涉及多種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子。兒童CVA的發(fā)病機(jī)制尚不明確，大多數(shù)研究認(rèn)為是由環(huán)境、遺傳、感染及免疫等因素相互作用所致。

圖 5 各組小鼠肺組織 TLR4、MyD88、NF-κB p65 表達(dá)的影響（±s，n=10）

圖6 各組小鼠肺組織TLR4和p-NF-κB p65免疫組化染色（400×）

現(xiàn)代研究普遍認(rèn)為Th1/Th2細(xì)胞亞群的失衡是CVA的重要發(fā)病機(jī)制之一[10]，Th2細(xì)胞刺激的2型免疫應(yīng)答與過(guò)敏和哮喘有關(guān)，其特征在于高抗體滴度和EOS增多。CVA發(fā)病過(guò)程中Th0過(guò)多向Th2轉(zhuǎn)化，從而使Th1細(xì)胞激活受抑制[11]。Th2細(xì)胞主要分泌炎癥細(xì)胞因子IL-4、IL-5和IL-13，能介導(dǎo)氣道黏膜的炎癥，加重CVA并促使其向哮喘發(fā)展。其中IL-4、IL-5 能誘導(dǎo) IgE 的產(chǎn)生，趨化 EOS[12]；IL-13 刺激EOS，引起AHR、黏液產(chǎn)生和膠原沉積[13]，三者共同作用，促使CVA氣道炎癥形成和發(fā)展。因此抑制這3種炎癥因子的生成是治療CVA的有效途徑。

TLR4作為參與非特異性免疫的重要蛋白，能夠識(shí)別外源性病原體并調(diào)控免疫，從而調(diào)節(jié)機(jī)體Th1和Th2兩種細(xì)胞的平衡。NF-κB在多種細(xì)胞中廣泛表達(dá)，正常情況下，NF-κB與其抑制劑IκB結(jié)合而失活。然而，在異常狀態(tài)下，當(dāng)上皮細(xì)胞受到刺激和損傷（如過(guò)敏性疾病）時(shí)，由于某些因子的激活，IκB與NF-κB分離，導(dǎo)致NF-κB活化，進(jìn)而引起大量炎癥因子基因表達(dá)[14]。TLR4能通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路，引起多種炎癥因子如IL-4、IL-5、IL-13基因的表達(dá)，這些表達(dá)的炎癥因子又重新激活了NF-κB通路，形成滾雪球式的正反饋調(diào)節(jié)[15]。

HLOL是由8味中草藥組成的混合物，其中麻黃作為止咳平喘的代表藥物，被證實(shí)能抑制細(xì)胞免疫和體液免疫，有抗哮喘作用，可緩解氣道平滑肌的收縮[16-17]；地龍具有松弛平滑肌、抗炎殺菌、平喘和免疫調(diào)節(jié)作用，研究發(fā)現(xiàn)地龍可有效抑制NF-κB的活化，降低IL-4、IL-5和IL-13的水平，減少體內(nèi)EOS炎癥[18]；苦杏仁可平喘鎮(zhèn)咳，亦有抗炎作用；紫蘇子能一定程度上抑制過(guò)敏反應(yīng)；桑白皮、前胡均能鎮(zhèn)咳祛痰；蟬蛻、旋覆花能緩解氣道高敏反應(yīng)狀態(tài)，解除支氣管平滑肌痙攣。

本次研究發(fā)現(xiàn)，HLOL能抑制CVA小鼠血清NEU的增多，減少CVA小鼠肺組織炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，降低AHR。HLOL通過(guò)抑制上游TLR4與MyD88結(jié)合，從而抑制TLR介導(dǎo)的MyD88依賴信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，進(jìn)一步降低或延遲下游NF-κB信號(hào)通路的活化，減少促炎細(xì)胞因子IL-4、IL-5和IL-13的釋放，從而緩解臨床癥狀。總而言之，HLOL能夠有效改善CVA模型小鼠的氣道炎癥及AHR，也為臨床診治小兒CVA提供新的治療思路，有望成為專病新藥應(yīng)用于臨床中。