中藥益母草的化學指紋圖譜及多組分定量分析方法的建立及應用研究

李寶輝，李冬暉，薛黨黨，趙 光

（中國人民解放軍聯勤保障部隊第九八九醫院中心實驗室，洛陽 471031）

益母草（Leonuri Herba）是唇形科植物（Leonurus japonicus Houtt.）的新鮮或干燥地上部分[1]，主要藥效成分為生物堿類、黃酮類、脂肪酸類、揮發油類化合物[2-3]，具有抗氧化、抗炎、抗血小板聚集等效用[4-5]。原料藥的質量是藥效發揮的重要保證。一些研究集中于定量分析益母草的已知成分來評價其質量[6-8]，事實上仍有部分重要化合物因未被確認而無法定量，因此需要聯用定量分析之外的其他技術來提升其質量控制的準確度和完整性。指紋圖譜技術聯合化學計量學可準確識別系統的微小差異，被廣泛用于復雜物質質量控制。已構建的益母草指紋圖譜集中于制劑和配方[9-10]，原料藥的指紋圖譜仍屬空白。本研究聯合高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜技術和多組分定量分析研究不同產地益母草原料藥。

1 實驗部分

1.1 益母草采集和化學品準備 研究共采集了本地區部分醫院中藥房和中藥材零售店的110份益母草，其中湖北 2018年批次 20份（#1～#20），江西2018年批次25份（#21～#45），河南2018年批次30份（#46-#75），新疆2018年批次35份（#76-#110）。將樣品打碎過40目篩后，分裝入塑料自封袋中，20℃避光保存。

標準品：蘆丁、芹菜素、槲皮素、山奈酚、鹽酸益母草堿、鹽酸水蘇堿（色譜純，源葉生物科技有限公司，上海）；其他化學品：甲醇（CH3OH）、乙醇（CH3CH2OH)、磷酸（H3PO4）、氫氧化鈉（NaOH）（分析純，大茂化學試劑廠，天津）。

1.2 HPLC試液制備及測量方法 益母草提取物制備：逐份準確稱取0.45 g益母草于50 mL錐形瓶中，加入80%乙醇-水溶液25 mL，用保鮮膜封口后置于BXP7200超聲儀超聲提取30 min（50℃，40 kHz），之后將提取物濾入25 mL容量瓶，80%乙醇-水溶液定容。HPLC實驗進樣前，將提取物過0.45μm濾膜。

應用Agilent 1260 HPLC-DAD檢測益母草提取物，色譜柱為Agilent Zorbax Eclipse Plus-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫20 ℃，進樣量 20 μL，流速1 mL/min，流動相為甲醇（A）和0.1%磷酸-水溶液（B），洗脫梯度：0～50 min，95%B～20%B，95%B平衡10 min，檢測波長270 nm。

應用Agilent 1260/6125 HPLC-MS鑒定益母草提取物的組成，采用電噴霧離子源，負離子檢測模式，毛細管電壓3.0 kV，錐孔電壓30 V，離子源溫度110℃，脫溶劑氣溫度350℃，錐孔氣流量50 L/h，掃描范圍 50～850 m/z。

1.3 HPLC定量分析及方法學考察 準確稱取各標準品以制備梯度為 800、400、80、40、10、0.1、0.01 μg/mL的標準品溶液，其中蘆丁、槲皮素、山奈酚的溶劑為甲醇，芹菜素的溶劑為0.01 mol/L NaOH，鹽酸益母草堿的溶劑為超純水。按“1.2”所述的HPLC方法檢測，5種標準品在梯度內線性良好（R＞0.999），見表1。

方法有效性驗證：在HPLC批量檢測前，從4個產地藥材中隨機各取出 1 份（#2，#31，#66，#101）做重復性實驗和中間精密度實驗。重復性實驗即同一份樣品連續進樣3次，檢測各組分峰面積的相對標準偏差（RSD）；中間精密度實驗即同一份樣品在當天 3 個時段（8∶00-12∶00，14∶00-18∶00，20∶00-24∶00）分別進樣，檢測各組分峰面積的RSD。選取5個色譜峰（C1、C4、C5、C6、C7，見圖 1）做 HPLC 方法學考察。重復性實驗的RSD為0.12%～0.44%，中間精密度實驗的RSD為0.21%～0.52%。

表1 5種化合物的HPLC定量線性方程

1.4 化學計量學方法 應用化學計量學中經典的模式識別方法評價HPLC指紋圖譜的效能，包括無監督模式識別方法[主成分分析（PCA）]和有監督模式識別方法[線性判別分析（LDA），最小二乘-支持向量機（LS-SVM），徑向基-神經網絡（RBF-NN）][11-13]。本研究所有數據的統計學分析均在MATLAB 7.0平臺完成。

2 結果

2.1 HPLC條件優化 HPLC條件優化以益母草提取物的色譜峰（C1、C4、C5、C6、C7，見圖 1）為對象，考查其理論塔板數、分離度、靈敏度和拖尾因子。應用正交實驗設計方案[L9（34）]優化實驗條件，最終選擇檢測波長為270 nm，進樣體積為20 μL，流動相B構成為0.1%磷酸水溶液。經過反復流動相梯度優化，獲得基線平整、峰窄尖無拖尾、分離度高的HPLC流出曲線，見圖1。

圖1 益母草提取物和標準品的HPLC流出曲線

2.2 HPLC指紋圖譜構建與評價 本研究采集了4個產地110份益母草，經HPLC檢測后，沒有發現隸屬于產地的特異色譜峰，因此應用遺傳-偏最小二乘法（GA-PLS）篩選特征變量[14]，獲得7個與產地相關的特征峰（C1-C7，見圖1），并以此構建益母草的HPLC指紋圖譜。

首先應用PCA探討110份益母草之間的相似度關系，結果見圖2。相同產地藥材的相似度較高，各自聚為一類，湖北藥材聚集在第3象限，江西藥材聚集在第2象限，新疆藥材聚集在PC1軸較正的1、4象限，河南藥材則處于其他3類樣品中間區域；但有少數樣品與同產地其他藥材相似度較低，例如湖北#6、江西#29和#37、河南#70和#75、新疆#91。

圖2 4個產地110份益母草的HPLC特征峰的PCA圖

為驗證該HPLC指紋圖譜的效能，應用有監督模式識別方法評價其客觀辨識度。首先用Kennard and Stone法將110份益母草分為兩組：校正集（73份）和預報集（37份），然后應用 LDA、LS-SVM和RBF-NN分別構建學習模型并比較模型的辨識能力。LDA模型結果：校正集識別率95.9%，預報集識別率 94.6%；LS-SVM 模型（γ=161.2，σ2=1.5）結果：校正集識別率97.3%，預報集識別率94.6%；RBF-NN模型（隱藏神經元數7，增加神經元數12，均方根差10-4）結果：校正集識別率98.6%，預報集識別率97.3%；3個模型均取得了較好的識別率，RBF-NN模型最優。

2.3 特征峰定性和定量分析 與標準品HPLCDAD、MS數據比對后，5個特征峰被準確鑒定，分別是鹽酸益母草堿（C1）、蘆丁（C4）、槲皮素（C5）、山奈酚（C6）和芹菜素（C7），見表2。之后用HPLC 外標法測定這5種特征組分的含量，見圖3。

表2 HPLC特征峰定性表

圖3 4種產地益母草的特征組分含量分布

湖北、河南和新疆益母草中4種黃酮類化合物含量呈現一致的分布，即蘆丁含量最高，山奈酚次之，之后是槲皮素，芹菜素含量最低，而江西產藥材槲皮素的含量明顯高于山奈酚（P＜0.001）；新疆和河南產藥材4種黃酮類化合物含量較高，分別居第1、2名；湖北、江西產藥材的山奈酚、槲皮素、芹菜素含量較低；江西和河南產藥材蘆丁的含量差異無統計學意義，湖北和江西產藥材芹菜素的含量差異無統計學意義。

110份益母草的鹽酸益母草堿的含量范圍是0.66～1.43 mg/g，新疆產藥材含量最高，湖北產藥材含量最低，江西和河南產藥材含量相近并居中。總之，多組分定量分析發現新疆、河南益母草質量較好，不同產地藥材中部分化合物具有相近的含量。

3 討論

中藥依賴其所含的多種化學成分共同發揮療效，有研究證實益母草的藥效成分受環境、產地、種植方式、收割時間、原材料初加工方式等因素的影響較大[15-16]，其質量控制一直是個難題。相較于傳統的經驗鑒別和單組分分析，色譜指紋圖譜技術由于其整體性的特征備受青睞。事實上，美國食品藥品監督管理局、英國草藥協會、加拿大藥用與芳香植物協會以及德國藥用植物協會均已批準將色譜指紋圖譜作為中藥的質量控制規范之一[17-19]。色譜指紋圖譜的另外一個特征是模糊性，強調準確的辨識，也就是強調樣品之間的相似度。本研究在指紋圖譜相似度分析的基礎上，應用模式識別方法構建定性預報模型，以評價HPLC指紋圖譜的有效性和對未知樣品的辨識度，取得了較好的結果。然而，指紋圖譜無法在“量”上為待分析物提供質量保證，而這正是多組分定量分析的優勢。

《中華人民共和國藥典》（簡稱藥典）2015版規定益母草飲片鹽酸水蘇堿的含量不得低于0.40%，鹽酸益母草堿的含量不得低于0.04%[20]；鹽酸水蘇堿具有興奮子宮、抗炎、抗血栓等多種藥理作用，鹽酸益母草堿主要發揮抗炎、抗凋亡、調節內環境Ca2+穩態等效用[2]。然而藥典并未對益母草中黃酮類化合物的含量提出要求，作為飲食中的非能量部分，黃酮類化合物一直被認為對健康有促進作用，尤其是可降低心腦血管疾病的病死率[21]。益母草中含量較高的黃酮類化合物包括蘆丁、槲皮素、山奈酚、芹菜素等，具有抗炎、抗氧化活性。

有效的制劑以及藥效的發揮需要優質的原料藥保證，本研究探討HPLC指紋圖譜技術聯合5組分定量分析在益母草原料藥質量控制中的應用。首先應用HPLC檢測4個產地110份益母草，在變量篩選方法（GA-PLS）的幫助下得到7個特征峰，并以此構建HPLC指紋圖譜；無監督/有監督模式識別模型均證實該指紋圖譜具有很好的辨別度，可準確鑒別不同產地的益母草，以RBF-NN模型為最優（校正集識別率為98.6%，預報集識別率為97.3%）；結合標準品的HPLC-DAD、MS數據，其中5個特征峰被確定為益母草堿、蘆丁、槲皮素、山奈酚和芹菜素；最后應用HPLC外標法檢測該5種特征組分的含量，結果顯示新疆和河南產藥材的各組分含量較高，河南、江西和湖北產藥材的部分化合物具有相近的含量。總之，HPLC指紋圖譜技術聯合多組分定量分析，可用于益母草的產地鑒別以及質量評價。