黃芩素對胰腺導管腺癌作用機制的研究進展*

張夢瑩 ，王毓睿 ，周 昆 ，彭雁飛 ，李文華 ，孫力康

（1.天津中醫藥大學中醫藥研究院，天津 301617；2.天津中醫藥大學中西醫結合學院，天津 301617；3.西藏民族大學醫學部，咸陽 712082）

胰腺癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，占到美國腫瘤病死率的第4位[1]。中國因胰腺癌死亡的人數2015年已達近8萬，且呈逐年遞增趨勢[1-2]。由于胰腺所處的解剖位置隱匿，早期疾病癥狀特征不顯著，且胰腺腫瘤轉移時間早等多種原因，導致大多數患者就診時已錯過最佳手術治療期。最新統計數據顯示，胰腺癌的發病率幾乎等同于致死率[3]。5年生存率僅為8%[4]。

1 胰腺癌的病因和發病機制

胰腺癌的病因與發病機制尚未完全清楚。有研究顯示胰腺癌的發生和發展是一個多病因、多步驟的復雜過程，物理、化學和生物等因素引起體內組織結構、代謝和基因表達的異常，其中后者是腫瘤發生和發展的核心[5]。胰腺癌發病的危險因素很多，其中吸煙這項危險因素早在1986年已被證實。食物中的危險因素尚不明確，動物實驗顯示脂肪代謝異常與胰腺癌有關[6]，在胰腺相關疾病中，特別是慢性胰腺炎、糖尿病是胰腺癌的高風險因子[7-8]。基因的改變是腫瘤發生和發展的分子生物學基礎。多數腫瘤的發生是由于致癌因素引起基因結構或功能的改變，使細胞增殖、生長和分化失控所致。從腫瘤分子遺傳學的角度研究表明，原癌基因的激活、抑癌基因的失活、生長因子、受體和DNA錯配修復基因的異常等在細胞癌變過程中起著關鍵作用。在胰腺癌基因和分子水平上的認識，可以概括為：1）腫瘤基因的激活，包括K-ras基因、Cerb-2基因等的激活。2）抑癌基因的失活，包括 p53、p16、DPC4 等的失活。3）生長因子的過度表達和信號轉導途徑異常，包括表皮生長因子（EGF）、轉化生長因子（TGF）-β、TGF-α 等[9]。

2 胰腺癌的診斷和治療

與其他消化道腫瘤不同，胰腺的解剖位置深，病理樣本采集難度大，導致臨床確診困難，雖然研究者對于胰腺癌的早期診斷投入了巨大的努力，但收效甚微[10]。有研究者推測至2030年，胰腺癌將成為惡性腫瘤中的第2位致死性疾病[11]。中國國家癌癥中心的數據統計結果顯示，中國每年胰腺癌病例數約占惡性腫瘤病例數的2.42%，發病例數為1.89萬[12]。

2018版胰腺癌綜合診治指南最具點睛之處在于把胰腺癌臨床診斷標準寫入新版指南之中。病理樣本的采集及隨后的病理學診斷仍然是胰腺癌診斷的“金標準”[13]。

在胰腺癌的外科治療中，根治性手術目前仍是胰腺癌患者能夠顯著延長生存時間的有效治療手段。據2017年德國癌癥研究中心對美國和歐洲6個國家近15年的胰腺癌手術狀況的統計分析，胰腺癌患者的手術切除率為13.2%～21.2%，手術后患者的預后與腫瘤分期、大小、手術切緣范圍及患者的個人體質有關[14]。

在內科治療中，化學治療（化療）仍是晚期胰腺癌的主要治療手段，化療作為姑息性手段，對于患者生存期的延長作用甚微。在之前甚至現在很長一段時間內，吉西他濱作為胰腺癌一線化療藥物，能有效抑制細胞復制，在大量的臨床試驗中其作用也得到了有效證實[15]。但目前吉西他濱化療藥耐藥性案例的不斷報道[16]，尋找其他切實有效的內科治療手段成為當下研究者亟待攻克的難題。隨著臨床研究的深入，相較于吉西他濱單藥治療而言，吉西他濱聯合其他化療藥物治療進展期胰腺癌的臨床效果更好，且可以較前者更多地延長胰腺癌患者生存時間[17-18]。也有研究者發現，一線藥物吉西他濱聯合中藥成方，或者聯合中藥單體臨床效果較吉西他濱單藥好，且可以減少耐藥情況的出現[19]。

中醫學對胰腺癌并無專病論述，“清熱解毒、活血化瘀”已成為中醫辨證治療腫瘤的重要原則。中醫藥抗腫瘤在臨床中應用廣泛，部分臨床和基礎實驗也揭示了中醫藥抗腫瘤的機制[20]。田同德等[21]的研究中，選擇中晚期胰腺癌60例，將赤芍、牡丹皮、半枝蓮、虎杖、蒲公英、蜈蚣等組成清熱解毒、活血化瘀方配合吉西他濱方案治療，并與單獨使用吉西他濱化療方案組30例作對照。結果表明相對于單獨使用吉西他濱組，吉西他濱配合清熱解毒、活血化瘀方，可以明顯減輕高中晚期胰腺癌患者的臨床癥狀，減少化療所產生的毒副作用，提高了患者的近期療效和臨床受益反應率。中藥成方烏梅丸是厥陰病的代表方，臨床上采用加味烏梅丸治療胰腺癌效果良好。張惠子等[22]研究發現，加味烏梅丸可以抑制胰腺癌移植瘤的生長，加味烏梅丸與吉西他濱聯合使用具有協同抑制作用，該抑制作用是通過促進人胰腺癌SW1990腫瘤細胞壞死及誘導人胰腺癌SW1990腫瘤細胞凋亡兩種主要機制實現的。

3 黃芩素抗胰腺腫瘤作用及機制的研究進展

黃芩素又稱為黃芩苷元，是傳統中藥黃芩中的主要有效成分之一，具有保護神經元、抗氧化、抗菌、抗病毒、抗過敏、抗炎癥、抗腫瘤等多種生理活性[23-25]。黃芩味苦，性寒，歸肺、膽、大腸、小腸經，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血安胎等功效，臨床用于濕溫、暑濕、胎動不安等的治療[26]。近年來黃芩素的抗腫瘤作用逐漸受到研究者的關注，目前研究發現黃芩素對多種腫瘤細胞增殖、運動遷移、細胞周期等均有較強的抑制作用，且黃芩素的抑制作用因腫瘤細胞種類不同也表現出不同[27-28]。

3.1 抑制胰腺癌細胞的增殖 失去控制的增殖是腫瘤細胞的典型特點。黃芩素能有效抑制胰腺腫瘤細胞的增殖，效果與吉西他濱相似。研究發現，當給予胰腺癌細胞BxPC-3和PANC-l細胞不同濃度的黃芩素，兩種腫瘤細胞的增殖都出現了明顯抑制，且增殖抑制呈劑量依賴性，當黃芩素濃度達到75 μmol/L和 100 μmol/L時增殖抑制作用與一線藥物吉西他濱2 μmol/L的增殖抑制效果相似[27]。李振磊等[28]的研究結果表明，黃芩素與吉西他濱聯用通過誘導GFPAC-1細胞凋亡的作用機制來實現對其的增殖抑制[29]。Song等[30]學者通過對BxPC-3、PANC-1及SW1990胰腺腫瘤細胞株的篩選，發現PANC-1具有較高的干細胞潛能，并發現黃芩素能夠通過Hedgehog通路有效抑制胰腺癌干細胞的增殖。神經前體細胞表達發育遲緩調節蛋白9（NEDD9），是一種定位于局灶性粘連中的支架蛋白，用于組裝局灶性粘連激酶（FAK）和非受體酪氨酸激酶c-Src，以調節多個細胞信號通路[31-32]。NEDD9在乳腺癌、結直腸癌和頭頸部腫瘤中有很高的表達，其表達水平與腫瘤細胞遷移、侵襲和轉移呈正相關[33-36]。Zhou等[37]學者證明，黃芩素能通過抑制NEDD9表達及其下游蛋白激酶B（Akt）和細胞外信號調節激酶（Erk）信號通路來達到抑制胰腺癌細胞BxPC-3和PANC-1增殖的目的。

3.2 抑制胰腺癌細胞的遠處轉移和運動遷移、侵襲能力 惡性腫瘤具有侵襲周圍組織的生物學特性。腫瘤細胞的轉移是惡性腫瘤侵襲性生長的具體表現，是腫瘤細胞從原發病灶脫離原位之后侵入周圍其他組織，隨后進入循環系統，包括血管、淋巴管等，最終形成轉移灶的生物學特征。腫瘤轉移的發生是導致患者死亡的最主要原因。有效抑制轉移灶的形成對最大限度控制胰腺癌致死率的作用不容忽視。Liu等[38]實驗研究證明，低劑量的黃芩素（10 μmol/L）聯合吉西他濱或多西他賽對胰腺癌細胞PANC-1遷移有很強的抑制作用，說明從胰腺癌細胞遷移方面來講，黃芩素能顯著增強吉西他濱或多西紫杉醇對PANC-1細胞體外遷移的抑制作用。膜細胞骨架連接蛋白Ezrin在胰腺癌的侵襲轉移過程中具有重要作用，其表達的下調可顯著抑制胰腺癌細胞的惡性增殖和侵襲遷移[39]。任學群等[40]進一步實驗研究發現，以低于IC50劑量的小劑量（10μmol/L）黃芩素不僅可以下調Ezrin mRNA的表達，而且顯著降低Ezrin蛋白的合成，這一效應呈劑量相關性，劑量愈增加抑制作用愈顯著。作者推斷下調人胰腺癌PANC-1腫瘤細胞Ezrin蛋白表達可能是黃芩素抑制腫瘤侵襲轉移的機制之一。

3.3 影響胰腺癌細胞的周期 細胞周期作為一種非常復雜的過程，與DNA損傷修復、損傷后組織增生、腫瘤的發生及器官的發育相關。臨床腫瘤化療的思路是先用放射或手術治療將腫瘤范圍縮小，使殘存的瘤細胞從G0期進入復制期后再用化療，其目的是增加腫瘤細胞對化療的敏感性[41]。在實驗研究中發現，黃芩素處理的BxPC-3和PANC-l胰腺癌細胞，細胞周期相關基因cyclin D1、cyclin E和cyclin A表達水平下降，表明黃芩素可以對胰腺癌細胞BxPC-3和PANC-1細胞周期產生影響[27]。對于細胞周期，周容濤[42]對其進行了更深入的研究，發現黃芩素干預BxPC-3和PANC-l胰腺癌細胞后，可以抑制BxPC-3和PANC-l細胞的細胞周期，并使細胞停滯在G0/G1期。

3.4 影響胰腺癌細胞的凋亡 細胞凋亡即細胞程序性死亡，是機體發育過程中重要的細胞調控手段。其在腫瘤的發生、發展中扮演重要角色，藥物能否促進腫瘤細胞的凋亡對能否有效控制腫瘤的發展起著關鍵作用。Takahashi等[43]研究發現，黃芩素不僅通過轉錄機制降低B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）蛋白家族的抗凋亡成員髓細胞白血病基因-1（Mcl-1）的表達，促進人PaCa細胞系的凋亡，同時黃芩素亦可通過線粒體釋放細胞色素C，激活半胱氨酸蛋白酶（Caspase）-3、Caspase-7和脫氧核糖核酸（DNA）修復酶多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（PARP）來誘導細胞凋亡，揭示了用黃芩素處理的人PaCa細胞系其抗凋亡蛋白Bcl-2和Mcl-1表達水平降低，Bcl-2相關的促凋亡蛋白（Bax）表達水平上調，且能夠誘導凋亡通路的關鍵信號分子細胞色素C的釋放及Caspase的活化。李振磊等[28]研究證實黃芩素及黃芩素聯合吉西他濱對胰腺癌細胞的影響。吉西他濱組和黃芩素聯合吉西他濱組的胰腺癌細胞CFPAC-1出現了典型的凋亡特征，包括核染色質濃縮、凋亡小體出現等，單獨黃芩素組也有相應變化，但程度較前者輕（P＜0．05），而未給予任何藥物干預的陰性對照組無此現象。

圖1 黃芩素調節胰腺癌細胞的分子機制

4 黃芩素在其他消化道腫瘤中作用及機制的研究進展

近幾年來，對黃芩及包括黃芩素在內中藥及化學單體抗腫瘤作用的研究報道逐漸增多，且研究結果與胰腺癌研究的結果相似，即黃芩及黃芩素等可以有效控制腫瘤細胞的增殖、腫瘤細胞遷移、促進腫瘤細胞的凋亡等。早在20世紀90年代，Inoue等[44]在研究黃芩素對鼠肝臟腫瘤細胞的抗增殖作用時，就發現黃芩素顯示出了較強的抑制肝腫瘤細胞增殖的活性。而在21世紀早期，基于網絡藥理學這一新興學科，Ma等[45]結合基因表達綜合數據庫中的微陣列數據（GSE95504），從系統水平揭示黃芩素的作用機制，研究者們發現CDK1、BRCA1、TUBB、HSPA1A、HSPA1B和HSPA4的過度表達與總體生存率顯著降低相關，而CDK1、CLU7、BRCA1和TUBB的過度表達與無病生存率顯著降低相關。這些數據綜合表明黃芩素通過一個涉及TP53、CDK1、HSPA1A和HSPA1B的PPI網絡對肝癌起到一定治療作用。在胃癌方面，王鶴霖等[46]發現，黃芩素不僅顯著抑制胃癌HGC-27細胞的細胞增殖和遷移，并促進細胞核染色質發生固縮形成凋亡小體而誘發腫瘤細胞凋亡。關于結直腸癌Kim等[47]研究發現，黃芩素能夠顯著激發結直腸癌HT-29細胞線粒體損傷及誘導HT-29細胞凋亡，且可以調節Bcl-2和Bax蛋白的表達，對線粒體功能產生影響，同時亦可以引發凋亡性DNA片段化、Caspase活化及PARP的裂解。而在食管鱗癌中Zhang等[48]研究發現，黃芩素通過P13K/Akt/NF-κB和P13K/Akt/mTOR信號通路抑制食管鱗癌細胞EC-109的增殖和促進腫瘤細胞凋亡。

5 展望

早在19世紀末，英國學者Paget提出“土壤-種子”學說，臟器微環境（“土壤”）可影響特定腫瘤細胞（“種子”）的種植、轉移和生長，腫瘤轉移早期常呈現特異性的臟器親和力。雖然學術界對于“腫瘤微環境”尚未有概念性的定論，但對于微環境對腫瘤細胞產生的影響已得到學者們的一致認同。胰腺腫瘤的微環境主要包括：胰腺癌基質微環境[49-50]和胰腺癌炎癥微環境等。其中，炎癥微環境中主要的炎癥細胞有巨噬細胞、肥大細胞和淋巴細胞[51-52]。大量研究證實：在胰腺癌中，胰腺的炎癥反應能在微環境改變的條件下促進胰腺腫瘤的發展[53]。其中，在對慢性胰腺炎及糖尿病的致癌機制探索中，研究者們發現，胰腺中的外分泌細胞在慢性胰腺炎的炎癥環境刺激下可以產生能促進腫瘤發展的上皮間質轉化樣改變的生物學特征[54]。而在糖尿病中，高血糖、高血脂的持續作用，可激活氧化應激和永久性促炎性反應狀態，這不僅打破了體內環境的穩態平衡，導致DNA突變，還使得細胞內線粒體能量代謝受阻，無法提供DNA修復所需能量，進而導致胰腺腫瘤的發生[55]。課題組長期關注胰腺癌腫瘤微環境的研究，關注中醫藥通過改善腫瘤微環境達到治療腫瘤的目的，研究國內外的相關報道后發現，微環境可以激活與重組胰腺細胞多種功能表型相關的腫瘤相關巨噬細胞（TAMs），這一功能表型的改變能對腫瘤的發生、演進、轉移和免疫抑制產生影響。而抗腫瘤中藥單體或處方可以以TAMs為靶點在不同的作用機制下對不同階段的腫瘤生長進行干預[56]。在實驗研究中也發現，在雨蛙素誘導的急性胰腺炎的體內外模型中，黃芩素可以通過NF-κB、MAPK和STAT3信號通路降低促炎細胞因子和趨化因子的表達，進而證實了黃芩素的體內外抗炎作用，解析了黃芩素緩解動物炎癥反應模型的機制[57]；同時，還揭示了黃芩素可以通過抑制巨噬細胞的炎癥反應來對腫瘤炎癥微環境產生作用，進而間接抑制大鼠胰腺腺泡細胞系AR42J的導管樣化生（ADM），因此推斷黃芩素對胰腺腫瘤發生產生的影響，預防慢性胰腺炎患者中胰腺腺泡細胞的導管樣化生，可以降低胰腺腫瘤的發生率[58]。胰腺腫瘤惡性程度極高，而區別于其他惡性腫瘤的最大特點是胰腺基質微環境中的纖維化和粘連的形成，其中腫瘤細胞激活并募集胰腺星狀細胞（PSCs）在胰腺癌基質微環境中有著不可替代的作用[59]。研究者Li等[60]發現當胰腺處于病理狀態時，炎癥微環境中的炎性細胞（如巨噬細胞等）會產生一系列的促炎性因子和生長因子來活化基質微環境的PSCs，活化的PSCs進一步促進胰腺腫瘤的發展。胰腺腫瘤微環境的復雜性無疑對科學工作者提出更多的挑戰，分析并鑒別胰腺癌病理標本中細胞類型及結構特征，建立更接近真實胰腺腫瘤微環境的研究模型，從而探索包括黃芩素在內的各種藥物對胰腺癌治療的潛在機制將會吸引更多的臨床醫務工作者和科研工作者早日為胰腺癌的治療提出更有效的方案。