基于PI3K/Akt通路探討脈絡寧注射液對早期糖尿病視網膜病變的作用

梅子寒 楊杰 王煒 曹鵬 楊艷 李鵬飛 朱可夫 江滔 張夢婷

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)是一種嚴重的致盲性糖尿病眼部并發癥。對中國1990～2017年45歲以上的糖尿病患者調查發現，DR 發病率為17.22%[1]。幾乎所有病程在 10 年以上的糖尿病患者都存在不同程度的視網膜病變[2]。DR導致的失明占所有失明人數的8.9%[3]?？梢?，DR的患病率高，致盲率高，嚴重影響國民生存質量，因此早期診斷、積極治療DR是防治糖尿病并發癥病變的一項重要內容。脈絡寧注射液由南京中醫藥大學附屬中西醫結合醫院(江蘇省中醫藥研究院)研制，由玄參、石斛、牛膝、金銀花、黨參等藥物提取后制成的中藥復方制劑，具有清熱化陰、活血化瘀的功效[4]。大量臨床研究證實該藥在糖尿病視網膜病治療方面療效顯著[5-8]。該藥能抑制體外高糖誘導的視網膜血管內皮細胞凋亡，對高糖環境下的視網膜內皮細胞有保護作用[9]。DR的發生發展是由多種細胞因子參與、炎癥、離子通道和信號轉導代謝酶共同調控的復雜過程。PI3K/Akt通路在細胞生長、增殖，分化過程中起著重要的作用，Akt 在視網膜組織中是一個內源性的視網膜生存因子。在高糖誘導的視網膜病變模型中，高糖環境直接或間接的抑制了內源性 Akt 的生成及表達，造成視網膜血管內皮細胞的凋亡增加，增殖減少。在糖尿病發生和發展過程中，持續的高血糖能夠促進PI3K/Akt通路活化，從而促使多種細胞因子合成與釋放，最終加速DR的發展過程。本研究基于PI3K/Akt信號通路在維持正常視網膜內皮細胞存活中所起的關鍵作用[10]，我們擬從該信號通路研究脈絡寧注射液防止早期糖尿病視網膜病變的作用機制，將進一步明確脈絡寧注射液在DR早期的治療作用及分子機制，并進一步為揭示DR早期病變的發病機制提供實驗依據。

1 實驗動物及細胞

SPF級SD雄性大鼠30只，體重200～220 g，由青島市藥檢所實驗動物中心提供。所有大鼠均飼養在標準化動物中心，單籠標準飼料喂養，自由進食和飲水，室溫18～22 ℃。人視網膜內皮細胞HRCEC(購自北京協和庫)。

2 實驗試劑及設備

鏈脲佐菌素(Sigma公司產品)；血糖儀、血糖試紙(美國強生Lifescan公司)；脈絡寧注射液(金陵藥業股份有限公司南京金陵制藥廠)；葡萄糖(Sigma公司產品)；DMEM培養基、胎牛血清(美國Gibco公司產品)；Akt、p-Akt、PI3K、Bcl2、caspase抗體(美國Santa Cruz公司)、二抗(美國Cell Signalling公司)；熒光定量PCR儀7500型(南京鈦格威生物技術有限公司)；Odyssey近紅外雙色激光成像系統(美國LICOR公司)；微量移液器(艾本德公司)。

3 DR模型的建立、分組及給藥

將30只SD雄性大鼠隨機分為正常對照組、模型組、脈絡寧組，每組10只。待各組大鼠體重在200～250 g時采用鏈脲佐菌素 (Streptozotocin,STZ)誘發糖尿病造模。造模前，將各組大鼠禁食12 h。用0.01 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液配成10 g/L的STZ，實驗組大鼠按60 mg/kg劑量左下腹腔內注射STZ，對照組大鼠注射等量的溶劑(0.01 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液)72 h后取尾血測血糖及尿糖。凡血糖≥16.7 mmol/L及尿糖陽性的大鼠定為糖尿病模型。自造模成功后開始進行脈絡寧注射液腹腔注射，每日一次，劑量為0.92 mL/kg(按照人臨床給藥量為10 mL,一日一次，大鼠換算系數為5.5進行劑量換算),連續給藥12 w?？瞻讓φ战M和模型組腹腔注射等體積的生理鹽水。

4 檢測磷酸化Akt蛋白在大鼠視網膜組織中的表達

給藥結束時處死各組大鼠取出左側眼球，沿著角膜緣剪開眼球的角膜，去除角膜、晶狀體和玻璃體后，用眼科刀將視網膜取出。Western blot檢測各組大鼠視網膜組織中p-Akt、Akt蛋白以及PI3K、Bcl2、Caspase 3水平。利用RIPA裂解液裂解4C°離心收集上清測定蛋白濃度，使用 2×還原上樣緩沖液調節各組蛋白濃度一致，100℃水浴保溫 5min，SDS-PAGE 電泳后，將蛋白轉移到PVDF膜上，1% BSA 封閉2 h，一抗4C°振蕩孵育過夜，TBST振蕩清洗三次，每次5 min。二抗室溫搖床振蕩孵育1 h，TBST振蕩清洗三次，每次5 min。HRP標記二抗用ECL顯色曝光，對照Marker記錄實驗結果。

5 細胞實驗

5.1體外培養HRCEC(人視網膜內皮細胞)

HRCEC細胞在含10% FBS的DMEM培養基中于37℃、5% CO2培養箱中進行培養。當細胞處于對數生長時，調整細胞數為 2×105/mL，每孔2 mL接種于6孔培養板中。將細胞分為三組：正常對照組、高糖組、脈絡寧組。除正常對照組外，其余各組均采用25 mmol/L葡萄糖進行高糖培養來模擬體內高糖環境，同時脈絡寧組加入0.8 μg/mL脈絡寧注射液，處理時間均為72 h。

5.2Westen blot檢測HRCEC細胞中Akt、p-Akt、PI3K、Bcl2、Caspase的蛋白水平

收集各組細胞，用PIPA裂解，4C°離心收集上清測定蛋白濃度，使用2×還原上樣緩沖液調節各組蛋白濃度一致，100C°水浴保溫5min，SDS-PAGE電泳后，將蛋白轉移到PVDF膜上，1% BSA封閉2 h，一抗4 ℃振蕩孵育過夜，TBST振蕩清洗三次，每次5 min。二抗室溫搖床振蕩孵育1 h，TBST振蕩清洗三次，每次5 min。HRP標記二抗用ECL顯色曝光，對照Marker記錄實驗結果。

5.3檢測動物實驗組大鼠視網膜中的中Akt、PI3K、Bcl2和Caspase 3 mRNA水平

6 統計學方法

7 結果

7.1絡寧注射液抑制HRCEC 細胞中p-Akt蛋白的表達

與正常對照組比較，高糖誘導組細胞中p-Akt蛋白水平明顯增加；脈絡寧給藥組p-Akt蛋白表達量明顯低于高糖誘導組(圖一)?？梢?，脈絡寧可以抑制高糖誘導的HRCEC 細胞中高水平的p-Akt的表達。

7.2脈絡寧注射液可降低糖尿病大鼠視網膜組織中p-Akt及其上游激酶PI3K以及下游促凋亡蛋白Bcl2、Caspase蛋白水平

與正常對照組大鼠比較，糖尿病大鼠視網膜組織中 p-Akt水平明顯增加，脈絡寧注射液給藥能抑制糖尿病大鼠中高水平的p-Akt，而AKT總蛋白在正常對照組、糖尿病組、脈絡寧給藥組之間無明顯變化。促進Akt發生磷酸化的上游激酶PI3K以及Akt下游的促凋亡蛋白Bcl2、Caspase的蛋白水平在各組間顯示出與p-Akt相同的變化趨勢，由此可見，脈絡寧注射液能抑制糖尿病大鼠中高水平的pAkt、PI3K、Bcl2和Caspase的蛋白表達(圖1)。

圖1 脈絡寧給藥對高糖誘導的pAkt表達的影響

7.3脈絡寧注射液可降低糖尿病大鼠視網膜組織中PI3K以及促凋亡的基因Bcl2、Caspase 3的表達

通過Real-time PCR的方法對Akt上下游相關的基因的檢測結果表明 AKT 的mRNA水平在正常對照組、糖尿病組、脈絡寧給藥組三組間的表達無顯著性差異(P>0.05)(表1);與正常對照組比較，PI3K的mRNA水平在糖尿病組和脈絡寧給藥組中均顯著升高(P<0.01)；與糖尿病組比較，脈絡寧顯著下調了PI3K的mRNA水平(P<0.05); Bcl2、Caspase mRNA在糖尿病組和模型組中均表達增加，脈絡寧干預后其表達水平均顯著降低。脈絡寧注射液顯著抑制了糖尿病大鼠視網膜中PI3K、Bcl2和Caspase的mRNA的表達。

圖2 脈絡寧給藥對糖尿病大鼠視網膜組織中中各Akt相關蛋白表達的影響

Fig.2 The effect of mailuoning on the expression of Akt related proteins in diabetic rat retinal tissue

表1 各組大鼠視網膜組織中Akt、PI3K、Bcl2、caspase mRNA相對表達量比較

注：采用單因素方差分析，與空白對照組比較，##：P<0.01，###:P<0.005;與模型組比較,*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.005

8 討論

DR是糖尿病微血管病變在眼底獨特環境中的表現，長期慢性的高血糖癥是其發病的基礎。DR發病的中心環節是高血糖癥及其引起的組織缺血缺氧導致的一系列病理改變，包括視網膜微血管的滲漏、閉鎖，進而造成視網膜組織水腫(尤其是黃斑水腫)、滲出、出血以及組織缺血缺氧引起的新生血管的形成，可進一步發展為玻璃體出血和牽拉性視網膜脫離，最終導致盲目[11]。DR的早期變化為視網膜的損傷，毛細血管基底膜增厚，周細胞和視網膜微血管內皮細胞(retinal microvascular endothelial cells，RMECs)喪失，其喪失的性質為細胞凋亡[12]。視網膜缺血使促血管生成物質增加，引起視網膜新生血管形成，從而導致增生性糖尿病視網膜病變的發生。周細胞對內皮細胞起支持作用，且具有收縮功能，可調節視網膜毛細血管局部的血流量和血管通透性，對于微血管結構和功能的穩定起著重要的作用；內皮細胞之間以緊密連接的方式相互連接，構成的血視網膜屏障 (blood retinal barrier，BRB)是其中最為重要的內屏障[13]。因此內皮細胞結構和功能的完整性對維持視網膜毛細血管的穩定性具有十分重要的作用，成為早期糖尿病視網膜病變治療的關鍵。

PI3K/Akt信號轉導通路由Akt、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)、促凋亡因子Bad(bcl-2-associated death protein,Bad)等一系列相關因子組成，通過促進細胞生長、增殖、凋亡等生命活動，來參與糖尿病、腫瘤等多種疾病的病理過程，是體內細胞存活的一條重要的通路[14-16]。大量研究表明Akt信號通路的激活能夠抑制各種各樣細胞凋亡刺激所誘導的程序性細胞死亡，且顯負性Akt干擾正常AKT信號能夠促進生長因子誘導的細胞生存[17-20]。在高糖誘導的視網膜病變模型中，高糖環境直接或間接的抑制了內源性Akt的生成及表達，促進磷酸化Akt的產生，造成視網膜血管內皮細胞的凋亡增加，增殖及遷移減少，大量的血管內皮細胞的凋亡造成血管閉塞，形成視網膜無灌注區。本實驗中，體外HRCEC細胞水平研究發現脈絡寧能抑制高糖誘導的HRCEC細胞中的pAkt水平的增加。體內糖尿病模型小鼠上研究發現，脈絡寧能抑制糖尿病大鼠視網膜中的高表達的pAkt并且也能抑制糖尿病大鼠中Akt的上游激酶PI3K以及下游促凋亡蛋白Bcl-2、Csapase3的基因mRNA的表達以及蛋白水平的增加。

綜上所述，我們通過大鼠糖尿病模型上的體內藥效試驗和在人視網膜細胞HRCEC上的高糖誘導的損傷模型上的研究揭示了脈絡寧注射液通過調控PI3K/Akt信號通路來介導對糖尿病視網膜細胞的保護作用從而改善早期糖尿病視網膜脈絡病變的作用。