京杭運河杭州段水體污染和細菌群落結構特征*

王 新 湯江武 吳逸飛 姚曉紅 孫 宏 沈 琦

(浙江省農業科學院植物保護與微生物研究所，浙江 杭州 310021)

細菌在水生態系統生物地球化學循環過程中具有重要作用[1-3]，不同功能類群細菌組成的群落決定了生態功能的特性和強弱，是維持水生態系統平衡的關鍵因素[4]193,[5]38。細菌群落同時也是水生態系統中最為敏感并極易受環境影響的生物群落，其演替的過程，既是對物質轉化和能量傳遞等生態功能變化的適應，也是對環境因子變化的生態響應。因此，研究細菌群落的結構和功能對了解水生態系統維持健康和平衡的機理非常重要[6]20404。

諸多環境因子如pH、溫度、營養鹽、有機質成分、污染物等均與水體細菌群落結構的變化有直接關系[7-11]。不同生境中的細菌群落結構是多種環境因子共同作用的結果。目前淡水微生物生態的研究中，已有不少研究開始關注城市河流，水質、環境等因子與水體細菌的關系，人為擾動是影響這類水體細菌群落結構的重要原因之一[12-14]，[15]118,[16]1176。但由于這類水體的復雜性和多樣性，仍需更多的研究來深化對城市河道微生物群落與環境因子關系的理解。相關研究的開展，對了解人類活動對水生態系統的影響，以及城市水生態系統的恢復和維護具有重要作用。

京杭運河杭州段自南向北貫穿杭州核心城區，匯集市區諸多城市河道，是杭州排洪防澇的骨干河道，具有重要的人文、景觀和生態功能[17]1,[18]1581。盡管近年來進行了大規模的綜合整治，但由于雨污分流不徹底，城市面源污染難以有效控制，京杭運河杭州段仍然是典型的易受城市生產、生活污染的河道。對該水體細菌群落與環境變化的研究，有助于了解京杭運河杭州段的水環境污染現狀和水體微生態過程，為區域水環境污染防控和綜合治理提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 采樣位點和采樣方法

分別于2015年1月20日(冬)、4月21日(春)、7月19日(夏)、10月26日(秋)，在京杭運河杭州段干流從上游向下游的顧家橋(30°17′4″N，120°12′19″E)、賣魚橋(30°17′31″N，120°8′56″E)、拱宸橋(30°19′15″N，120°8′5″E)和義橋(30°22′33″N，120°7′27″E)4個位點分季節采樣4次。采樣位點如圖1。由于京杭運河杭州段河道水體分層不明顯，故僅采集表層樣品進行研究。

1.2 樣品的采集和處理

在采樣現場用梅特勒SG98型多參數分析儀測定采樣點的溫度和溶解氧，用2 L 有機玻璃采水器采集表層河水(0～30 cm)1.5L，立即帶回實驗室處理。總菌計數樣品經8 μm孔徑濾膜過濾后取20 mL，用經0.22 μm孔徑濾膜過濾的福爾馬林(最終體積分數5%)固定，裝入無菌樣品瓶中，4 ℃保存。隨后取0.3 L水樣用0.22 μm孔徑濾膜過濾收集菌體，濾膜用鋁箔包裹，液氮速凍后裝入凍存管，存于-80 ℃冰箱以備提取基因組DNA。剩余樣品分別用于細菌胞外酶活性和水質參數的測定。

1.3 總菌計數和β-葡萄糖苷酶活性的測定

總菌計數采用熒光染色計數法[19]。β-葡萄糖苷酶活性的測定采用熒光模擬底物(FMS)法[20]進行，以胞外酶水解底物的速率來表示其活性，具體參照文獻[21]、[22]描述的測定方法進行。

圖1 采樣位點示意圖Fig.1 Sampling stations

1.4 細菌群落結構的聚合酶鏈式反應(PCR)-變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析

1.4.1 DNA提取

將收集了大量菌體的濾膜在無菌工作臺中剪成碎片，采用PowerWater?DNA提取試劑盒提取水樣中的基因組DNA。提取獲得的DNA樣品用超微量分光光度計(NanoDrop-2000)測定濃度后置于-20 ℃保存備用。

1.4.2 PCR-DGGE分析

以提取的樣品的基因組DNA為模板，PCR擴增16S rDNA V3區片段，引物為連有GC-夾子(5’-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G-3’)的Eubac341f (5’-TAC GGG AGG CAG CAG-3’)和Eubac517r (5’-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’)[23]，參考文獻[21]描述的方法進行PCR擴增。擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后用Bio-Rad公司的D-code System進行DGGE分析。聚丙烯酰胺凝膠濃度為8%，變性梯度為40%～60%。60 ℃、40 V條件下電泳1.5 h后升電壓至120 V，電泳5.0 h。聚丙烯酰胺凝膠從電泳儀上取下之后，在EB染液中染色25 min，用TANNON-2500凝膠成像系統采集圖像。

1.5 DGGE條帶的回收、克隆、測序及分析

DGGE凝膠中的主要條帶切下后用dd H2O沖洗，搗碎后用30 μL TE buffer 在4 ℃下浸泡12 h，PCR回收切下條帶中的DNA。回收條帶的PCR產物再次經DGGE檢測以確保回收條帶PCR產物的正確。PCR產物用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒純化后連入pMD18-T載體，轉入大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5感受態細胞，采用菌落PCR檢測陽性克隆，每個樣品隨機挑選3個載有插入片段的陽性克隆送交上海某公司測序。測序結果在GenBank中比對分析之后用MEGA 4.1軟件以Neighbor-Joining法構建系統發育樹，各分支的Bootstrap置信度用1 000次自導復制來評價。

1.6 細菌群落結構與環境因子關系分析

獲得的DGGE圖譜用Quantity One-1-D軟件對DGGE條帶進行數字化分析，用條帶灰度大小來代替每個條帶的擴增量，將不同泳道的條帶組成一個數字化矩陣，進行均一化處理，以每個條帶灰度占該泳道總灰度的百分比形成新的矩陣，消除各泳道上樣量的差異。采用限制性排序分析細菌群落結構與溫度、溶解氧、高錳酸鹽指數、總氮、氨氮、亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮等環境因子之間的相互關系，由于去趨勢對應分析(DCA)特征軸最大長度<3，故采用冗余分析(RDA)進行分析。

1.7 水質參數測定

高錳酸鹽指數采用堿性高錳酸鉀氧化法測定。硝酸鹽氮、亞硝酸鹽氮、氨氮和總氮均采用氣相分子吸收光譜法測定。

1.8 數據統計分析

采用SPSS 13.0軟件進行單因素方差分析，采用Tukey氏法多重比較檢驗。以P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 水體環境和水質參數的季節變化

2.1.1 溫度和溶解氧的季節變化

京杭運河杭州段冬季、春季、夏季和秋季的平均溫度分別為(9.0±0.5)、(20.0±0.5)、(28.0±0.5)、(13.0±0.5) ℃，從上游的顧家橋到下游的義橋，各個采樣點在相同季節的水溫差異不顯著。冬季、春季、夏季和秋季的溶解氧平均值分別為(7.76±0.50)、(5.17±0.44)、(1.60±0.43)、(5.44±0.32) mg/L，夏季溶解氧最低；各個采樣點中，上游的顧家橋在4個季節中均最高。

2.1.2 水質的季節變化

各個季節高錳酸鹽指數從上游到下游大體呈遞增趨勢(見圖2)，義橋的高錳酸鹽指數顯著高于其他幾個采樣點。京杭運河流經杭州城區過程中污染物增加。

圖2 高錳酸鹽指數的季節變化Fig.2 The seasonal changes of permanganate index

其他水質指標的季節變化見圖3。氨氮和總氮在4個季節，從上游到下游大體呈遞增趨勢，義橋的氨氮和總氮含量顯著高于其他幾個采樣點。以平均值最高的冬季為例，顧家橋、賣魚橋、拱宸橋、義橋的氨氮分別為1.11、1.34、2.39、3.40 mg/L，總氮分別為2.97、5.00、6.27、7.66 mg/L。各個采樣點水樣氨氮和總氮含量存在季節變化，但不具明顯規律。總體上硝酸鹽氮含量上游采樣點高于下游，亞硝酸鹽氮含量則具有和氨氮類似的變化趨勢。上述數據表明，杭州城區污染物的輸入，尤其是高錳酸鹽指數和氨氮，對京杭運河的水質具有重要影響。

2.2 細菌豐度和胞外酶活性的季節變化

2.2.1 細菌豐度的季節變化特征

細菌豐度的季節變化如圖4所示。從上游的顧家橋到下游的義橋，各位點細菌豐度除顧家橋在夏季偏高外，均呈顯著上升趨勢。以春季為例，顧家橋、賣魚橋、拱宸橋、義橋的細菌豐度分別為3.62×106、5.88×106、6.39×106、8.53×106個/mL。這與京杭運河經過杭州城區過程中，可能存在外源生物、化學污染物的輸入有關。在相同采樣點的不同季節，細菌豐度在冬季和春季與夏季和秋季有著顯著的差異。

2.2.2 細菌胞外酶活性季節變化特征

在不同季節，β-葡萄糖苷酶活性具有不同特征(見圖5)。冬季從上游到下游的位點逐步遞增，從顧家橋的0.378 μmol/(L·h)增至義橋的0.637 μmol/(L·h)；春季則逐步遞減，從顧家橋的0.366 μmol/(L·h)減至義橋的0.186 μmol/(L·h)；秋季逐步增加，但各采樣點的差異不顯著；夏季則無明顯變化特征。以平均值比較，β-葡萄糖苷酶活性在冬季顯著高于其他季節，冬季平均值達0.511 μmol/(L·h)；而春季、夏季、秋季β-葡萄糖苷酶活性則無顯著差異。

圖3 氨氮、總氮、硝酸鹽氮、亞硝酸鹽氮的季節變化Fig.3 The seasonal changes of ammonia nitrogen,total nitrogen,nitrate nitrogen and nitrite nitrogen

圖4 細菌豐度的季節變化Fig.4 The seasonal changes of bacteria abundance

2.3 細菌群落的季節變化

采用PCR-DGGE獲得了16S rDNA V3區片段指紋圖譜(見圖6)。泳道中的不同條帶表示不同種細菌操作分類單元(OTU)，條帶數顯示了水體細菌的多樣性，盡管不同位點不同季節的DGGE指紋圖譜在條帶亮度上有差異，但細菌種類差異不大。

圖5 β-葡萄糖苷酶活性季節變化Fig.5 The seasonal changes of β-D-glucosidase activity

對DGGE圖譜中的主要條帶進行了測序和分析，通過系統發育樹分析顯示了京杭運河杭州段水體中細菌的主要種類(見圖7)。主要集中在變形菌門(Proteobacteria)(37.8%)、放線菌門(Actinobacteria)(24.3%)、擬桿菌門(Bacterioidetes)(18.9%)、厚壁菌門(Firmicutes)(10.8%)和藍藻門(Cyanobacteria)(8.1%)幾個細菌門中。而DGGE圖譜中，條帶7、15、29、31均屬于黃桿菌(Flavobacterium)，條帶18屬于厚壁菌(Firmicutesbacterium)，條帶30屬于放線菌(Actinobacterium)，它們所代表的細菌是京杭運河杭州段水體中大多數時間的優勢細菌。

采用限制性排序分析了細菌群落結構與環境因子之間的關系。所有位點中，義橋和顧家橋主要分布在第一、第二象限，拱宸橋和賣魚橋主要分布第三、第四象限(見圖8)。整體上來看，從上游的顧家橋到下游的義橋，水體細菌群落結構變化明顯。溶解氧、硝酸鹽氮含量與細菌群落結構差異性呈正相關，其他環境因子與之呈負相關。高錳酸鹽指數和總氮是關鍵影響因子。

注：圖譜中條帶標記數字為切膠測序分析的條帶編號。圖中泳道標記A、B、C、D分別為義橋、拱宸橋、賣魚橋、顧家橋，字母后數字1、2、3、4分別為冬季、春節、夏季、秋季，圖8同。

圖6 細菌16S rDNA V3區片段DGGE指紋圖譜
Fig.6 DGGE profiles of 16S rDNA V3 fragments
of bacteria

3 討 論

人類活動對水環境的影響多年來受到廣泛的關注，城市作為人口的主要聚集區，生產、生活產生的污染物的輸入，對城市河道乃至區域水環境的水質和水體生態都有著重要的影響[24]139,[25]。京杭運河杭州段自錢塘江引水，流經市區的過程中，由于地勢低洼，匯納了市區河網帶來的各種污染物，更有諸多生活污水直排入河[17]1。萬歡等[18]1586在2004年通過水體細菌種類的研究推斷市區有機和無機污染物的輸入相當嚴重。ZHANG等[24]141在2008—2013年對杭州地區河網的長期連續監測中發現，市區河道氨氮的濃度是其他區域河道的3～5倍，是區域氮污染的重要源頭之一。近年來隨著水污染治理工作的開展，生活污水截污納管，其向河網的輸入量大大減少，京杭運河杭州段水體水質明顯好轉。然而本研究中，從上游顧家橋到下游義橋，在各個季節，水體中的高錳酸鹽指數、氨氮、總氮以及細菌豐度，大體呈遞增趨勢，充分說明由市區帶來的污染仍然是京杭運河水體污染的重要原因。

圖7 16S rDNA V3區片段PCR-DGGE切膠條帶測序結果的系統發育樹分析Fig.7 Phylogenetic tree of 16S rDNA gene sequences obtained by PCR-DGGE

圖8 細菌群落結構與環境因子的RDA分析Fig.8 RDA analysis of bacterial community structure and environmental parameters

細菌是水體中對環境變化響應最為敏感、對污染物的轉化和去除最為重要的功能類群，關系到水體生態系統的維持、修復和平衡，因而一直是研究的熱點[5]46,[6]20404。水體中的胞外酶主要由細菌產生，大多數大分子有機物的轉化過程必須有細菌胞外酶的參與才可能完成[26-27]，因此在一定程度上，細菌胞外酶的活性意味著細菌的活性[21]。本研究中水體β-葡萄糖苷酶活性冬季顯著高于其他季節，而以4個位點的平均值計，冬季是細菌豐度和高錳酸鹽指數、氨氮、總氮最高的季節，這也表明細菌的活性也對水體污染物的變化有明顯的響應，水體細菌具有天然的污染去除和水體修復功能。

水體細菌實現其生態活性和生態功能的基礎是其功能類群的組成[4]196。近年來，一些城市河道水體微生物群落結構和多樣性的研究促進了人們對不同河道水體中細菌功能類群的認識。如南京秦淮河主要細菌種類是變形菌門、放線菌門和厚壁菌門[28]1165，贛江是變形菌門和放線菌門[29]385，美國南加州的一條城市河道中則是變形菌門、擬桿菌門和酸桿菌門(Acidobacteria)[16]1180。京杭運河杭州段水體主要細菌類群與多年來人們對淡水生態系統主要細菌類群的認識是一致的[30-32]。

不同河道水體細菌群落結構的差異，既是細菌對水體環境因子變化的響應，也是受到多種環境因子變化共同驅動的結果。CAI等[28]1165認為，溫度、總氮、N/P和氨氮是秦淮河水體細菌群落結構的主要影響因素；WANG等[29]385認為，溫度和流速是影響贛江南昌段水體細菌群落的主要環境因子；ZHANG等[15]118對上海市內3條河道的研究表明，溫度、總溶解性固體(TDS)、pH和鹽度均與細菌群落結構變化有關，其中溫度是首要的影響因子。本研究對京杭運河杭州段的研究表明，高錳酸鹽指數和總氮是主要的影響因素，而這兩種污染物主要來源于京杭運河流經杭州市區的被動輸入，這表明城市源對京杭運河杭州段的水體水質和生態系統有著關鍵的影響，京杭運河杭州段的水體污染治理，依賴于杭州城區點、面源污染的管理和控制。

4 結 論

(1) 京杭運河杭州段從上游顧家橋到下游義橋，高錳酸鹽指數、氨氮和總氮、細菌豐度大體呈遞增趨勢，冬季水體總體污染水平及細菌豐度均顯著高于其他季節。京杭運河流經杭州市區時的污染物被動輸入是水體污染的主要原因。

(2) 京杭運河杭州段水體中細菌的主要種類集中在變形菌門、放線菌門、擬桿菌門、厚壁菌門和藍藻門等5個細菌門中，所占比例分別為37.8%、24.3%、18.9%、10.8%和8.1%，分別屬于黃桿菌、厚壁菌和放線菌的細菌是京杭運河杭州段水體中大多數時間的優勢細菌。

(3) 京杭運河杭州段水體細菌群落結構從上游到下游變化明顯，高錳酸鹽指數和總氮是影響細菌群落結構差異的關鍵因子。