大鼠80%門靜脈結(jié)扎殘肝組織中CyclinD1和PCNA的表達與肝再生的關(guān)系分析＊

劉俊 ，陽普根 ，鄢業(yè)鴻 ，歐陽亮遠 ，李包根 ，陳歡 ，李劍峰 ，肖建生

（1.江西省宜春市人民醫(yī)院，宜春 336000；2.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南昌 330006）

我國是肝癌病率最高的國家之一，每年因患肝癌死亡的人數(shù)超過10萬余人[1]。臨床上主要治療方式為手術(shù)切除，但大多數(shù)病人已是中晚期，且合并有肝硬化剩余健康肝臟較少，手術(shù)切除過多肝臟后會使得患者肝組織無法滿足全身機體的代謝需要[2]。上世紀已有門靜脈結(jié)扎術(shù)，但尚未引起普遍重視。辛昊揚等[3]研究表明：對巨大肝癌病人肝切除術(shù)前采取結(jié)扎或栓塞腫瘤側(cè)肝臟的門靜脈。可以使得肝臟腫瘤萎縮，未栓塞側(cè)的肝組織增生肥大進而擴大肝臟容積，可在一定程度上減少肝功能衰竭的發(fā)生率。本實驗建立大鼠80%門靜脈結(jié)扎(PVL)組和80%肝切除(PH)組模型，初步探討80%門靜脈結(jié)扎殘肝組織中CyclinD1和PCNA的表達與肝再生的關(guān)系，為臨床提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 雄性SD大鼠72只，體重(220±20)g，由南昌大學(xué)實驗動物中心提供。大鼠飼養(yǎng)于清潔動物飼養(yǎng)室，室溫控制在20℃-25℃，采用常規(guī)分籠，自由進食普通飼料、自來水，定期更換清潔飼料，維持12小時晝夜節(jié)律。該實驗經(jīng)過動物倫理委員會批準(zhǔn)同意。

1.2 藥物與試劑 兔抗大鼠PCNA單克隆抗體購自武漢博士德生物公司；PV-6002購自北京中杉金橋生物公司；總蛋白提取試劑盒購自上海貝博生物；兔抗大鼠CyclinDl抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、0.9%氯化鈉注射液、5%葡萄糖注射液、芐星青霉素、5%水合氯醛、10%中性福爾馬林固定液、安爾碘均購自本院醫(yī)學(xué)實驗中心。

1.3 儀器 7600型型全自動生化分析儀購自日立公司；Bx-60型顯微鏡購自日本OLYMPUS公司；彩色病理圖像分析系統(tǒng)購自日本NIKON公司；Tanon-2500凝膠成像系統(tǒng)購自上海天能科技有限公司；LD5-2A低速離心機購自北京醫(yī)用離心機廠；低溫冰箱、臺式高速低溫離心機購自Beckman公司；HW.SY電熱恒溫水浴鍋購自北京長風(fēng)儀器儀表公司；SH-5加熱恒溫磁力攪拌器購自北京金北德工貿(mào)公司。

2 方法

2.1 分組及建立模型 雄性SD大鼠72只，采用隨機數(shù)字表法分為3組，每組各24只；PVL組：(n=24)行80%大鼠肝葉門靜脈結(jié)扎術(shù)，80%門靜脈結(jié)扎組大鼠術(shù)前禁食12h，不禁飲，5%水合氯醛按0.5ml/100g的劑量進行腹腔注射麻醉，將大鼠以仰臥位固定于自制手術(shù)臺上，切口周圍備皮，并以安爾碘消毒，取上腹正中切口，于劍突下切開皮膚，肌肉及腹膜，切口長約2.0-4.0cm，拉開以暴露腹腔，暴露腹腔后腰背部墊一腰橋，暴露肝臟，切斷肝周韌帶，將胃腸用無菌棉簽推向尾側(cè)，顯露肝門后用無菌棉簽于肝十二指腸韌帶前筋膜分離門靜脈，根據(jù)Gershbein等[4]的方法（肝左外葉30%，中葉約40%，尾狀葉約10%），用6-0絲線于遠離肝葉血管蒂根部依次結(jié)扎肝左外葉、肝中葉，肝尾狀葉門靜脈，肝動脈及膽管保持完整，保留肝右上葉、肝右下葉。檢查肝臟無活動性出血，以生理鹽水沖洗腹腔后，逐層絲線縫合關(guān)閉腹腔；術(shù)后皮下注射芐星青霉素的生理鹽水2ml(8萬μ/ml)預(yù)防感染。PH組：行80%大鼠肝葉切除術(shù)，術(shù)中用6-0絲線在遠離肝葉血管蒂根部依次縫扎肝左外葉、肝中葉、肝尾狀葉、肝蒂，切斷肝蒂移出標(biāo)本，保留肝右上葉、肝右下葉，確定肝蒂殘端無出血。其余手術(shù)步驟同PVL組。Sham組：(n=24)進腹后僅翻動肝左外葉、肝中葉、肝尾狀葉，游離出門靜脈各分支，即關(guān)腹。若在實驗過程中有大鼠死亡立即補上，保證實驗各組大鼠檢測個指標(biāo)時總數(shù)一致（除生存率檢測外）。

2.2 術(shù)后取材 術(shù)后 24h、48h、72h、120h每組分別處死6只大鼠，觀察肝臟大體形態(tài)變化腔靜脈抽取靜脈血3ml，室溫靜置2h后，再以2000r/min的速度離心15min后將所得上清液血清置于-20℃冰箱保存；切取肝臟稱重，分別取2塊1cm×0.5cm×0.5cm大小的肝臟組織，1塊立即置于液氮中保存。

2.3 檢測項目

2.3.1 比較各組大鼠生生存率 術(shù)中觀察大鼠肝臟的外觀改變。術(shù)后定時觀察大鼠的一般情況，包括一般生命體征，精神狀態(tài)、飲食及反應(yīng)，記錄術(shù)后24h、48h、72h、96h、120h 的生存情況， 并制作生存曲線圖。

2.3.2 肝臟肝再生指數(shù)檢測 檢測大鼠體重后處死大鼠，切取大鼠的肝臟，擦拭肝臟表面的血跡后檢測肝臟質(zhì)量，使用電子稱測量大俗肝臟濕重，門靜脈結(jié)扎組大鼠分別要減去結(jié)扎肝葉的肝重，并計算肝臟再生指數(shù)。肝再生指數(shù)=肝臟濕重/體重×100%

2.3.3 血清ALT、AST水平檢測 取出腔靜脈抽取靜脈血3ml，室溫靜置2h后，再以2000r/min的速度離心15min后將所得上清液血清，使用全自動生化分析儀分別檢測各組大鼠丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(Alanine aminotransferase，ALT) 和谷草轉(zhuǎn)氨酶（Aspartate transaminase，AST）含量水平。

2.3.4 Western blot檢測蛋白表達水平 使用Western blot檢測大鼠CyclinD1蛋白，取大鼠肝臟組織，使用胰蛋白酶消化后，提取總蛋白，使用半干法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜，置于5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后加入各需要檢測蛋白的一抗，二抗，孵育2 h，以β-actin為內(nèi)參蛋白，采用顯色液顯色后行吸光度分析，計算各蛋白相對表達量。

2.3.5 免疫組化 按說明書采用PCNA染色試劑盒進行免疫組織化學(xué)染色。實驗結(jié)果的評定標(biāo)準(zhǔn)PCNA以細胞核呈界限清楚的綜色反應(yīng)為陽性。PCNA陽性的肝細胞是指那些在肝細胞核內(nèi)呈界限清楚的綜色細顆粒狀物質(zhì)。每張切片隨機選。擇10個視野每個視野記數(shù)100個肝細胞，光鏡100倍下計數(shù)PCNA陽性細胞數(shù)，按下列公式計算PCNA陽性細胞指數(shù)。PCNA指數(shù)=PCNA陽性細胞數(shù)/全部肝細胞數(shù)×100%。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 本研究數(shù)據(jù)分析采用軟件為SPSS 22.0，作圖采用軟件為GraphPad Prism5，計量資料采用（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間采用單因素方差分析，生存分析通過軟件繪制Kaplan-Meier生存曲線，并采用Wileoxon檢驗(Gehan比分法)進行生存率的比較，若P＜0.05則表明數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義，本研究所有檢驗均為雙側(cè)檢驗。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠術(shù)后生存情況 PVL組大鼠120h生存率為87.50%顯著高于PH組62.50%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表 1。

3.1 各組大鼠肝臟再生指數(shù)比較 由表2可以看出在24h時相比PVL組，PH組大鼠肝臟再生指數(shù)顯著升高（P＜0.05），Sham 組無顯著變化（P＞0.05）；48h、72h、120h時，相比PVL組，PH組和Sham組大鼠肝臟再生指數(shù)均顯著降低（P＜0.05）。

表1 各組大鼠術(shù)后生存情況（n，%）

表2 各組大鼠肝臟再生指數(shù)比較

3.2 各組大鼠術(shù)后血清ALT比較 由表3可以看出，24h、48h、72h、120h 時， 相比 PVL 組，PH 組大鼠血清ALT均顯著升高，Sham組大鼠血清ALT均顯著降低 （P＜0.05）；120h時3組大鼠ALT水平均無顯著差異（P＞0.05）。

表3 各組大鼠術(shù)后血清ALT比較

3.3 各組大鼠術(shù)后血清AST比較 由表4可以看出，24h、48h、72h 相比 PVL 組，PH 組大鼠血清AST水平均顯著升高，Sham組大鼠血清AST水平均顯著降低 （P＜0.05）；120h時3組大鼠AST水平均無顯著差異（P＞0.05）。

3.4 門靜脈結(jié)扎組與肝切除組大鼠術(shù)后CyclinD1相對表達量比較 由表5可以看出，相比PVL組，PH組24h大鼠肝臟CyclinD1相對表達量顯著升高 （P＜0.05）；48h、72h、120h 大鼠肝臟 CyclinD1 相對表達量均顯著降低（P＜0.05）。

3.5 門靜脈結(jié)扎組與肝切除組大鼠術(shù)后PCNA陽性率比較 由表6可以看出，相比PVL組，PH組24h大鼠肝臟PCNA陽性率顯著升高 （P＜0.05）；48h、72h、120h大鼠肝臟PCNA陽性率均顯著降低（P＜0.05）。

表4 各組大鼠術(shù)后血清AST比較

表5 門靜脈結(jié)扎組與肝切除組大鼠術(shù)后CyclinD1相對表達量比較

表6 門靜脈結(jié)扎組與肝切除組大鼠術(shù)后PCNA陽性率比較

4 討論

臟容積或肝臟重量是直接反映肝臟再生最客觀的指標(biāo)，肝臟再生指數(shù)是較為簡單和直觀評價肝臟再生情況的指標(biāo)[5]。本研究發(fā)現(xiàn)24h時相比PVL組，PH組大鼠肝臟再生指數(shù)顯著升高，Sham組無顯著變化 （P＞0.05）；48h、72h、120h 時， 相比PVL組，PH組和Sham組大鼠肝臟再生指數(shù)均顯著降低。說明使用門靜脈結(jié)扎相比切除肝臟可以促進肝臟再生。這可能是因為結(jié)扎部分門靜脈分支后，結(jié)扎側(cè)的肝葉出現(xiàn)萎縮，而非結(jié)扎側(cè)的肝葉呈現(xiàn)代償性增生肥大，可以促進非結(jié)扎側(cè)的肝臟再生，使得肝臟再生指數(shù)顯著高于其他各組。陳騁等[6]研究表明：門靜脈結(jié)扎后對側(cè)肝臟均的再生能力顯著增強，與本研究得出的結(jié)論相一致。

血清ALT、AST活力的大小是檢驗肝臟損傷的重要指標(biāo)之一[7]。王燦紅等[8]研究表明：血清ALT、AST活力的大小，直接反映了肝細胞受損的程度。本實驗中可以看出，24h、48h、72h時相比PVL組，PH組大鼠ALT和AST含量水平均顯著升高，但在120h時三組ALT和AST含量水平無顯著差異。說明門靜脈結(jié)扎術(shù)在72h內(nèi)會對肝臟的功能有一定的影響，但會促進肝臟的再生，使得肝臟功能逐步恢復(fù)，在120h基本可以恢復(fù)。

Cyclin D1是肝細胞進入細胞增殖周期的主要標(biāo)志物，Cyclin D1的表達、活化是增殖階段一個重要的調(diào)控位點[9，10]。PCNA是真核細胞DNA合成所需的一種DNA多聚合酶δ的輔助蛋白，它與細胞周期密切相關(guān)，直接參與細胞增殖過程中DNA的復(fù)制，其含量和表達程度變化與DNA合成情況一致，反映了細胞的增殖活性[11，12]。本研究發(fā)現(xiàn)相比PVL組，PH大鼠 24h肝臟 PCNA、Cyclin D1表達顯 著 升 高 （P ＜0.05），48h、72h、120h 大 鼠 肝 臟PCNA、Cyclin D1相對表達量均顯著降低。說明門靜脈結(jié)扎術(shù)后48h，肝臟細胞開始增殖，肝臟開始迅速再生，且再生速度顯著高于直接切除。這可能是因為肝切除術(shù)后，由于肝量突然減少肝切除比門靜脈結(jié)扎肝血流動力學(xué)的變化是更迅速明顯有助于更快速激活肝細胞增殖，PH導(dǎo)致大鼠殘存的肝葉在24h時PCNA標(biāo)記指數(shù)和Cyclin D1達到高峰。門靜脈結(jié)扎會使得肝臟處于高動力性循環(huán)狀態(tài)，通過激活誘發(fā)各種內(nèi)皮細胞釋放生長因子，促進肝再生，使得48h之后肝臟內(nèi)的相關(guān)增殖因子表達增加，促進了肝臟的再生。同時可能與肝動脈緩沖效應(yīng) (hepatic artery buffer response HABR)有關(guān)，即當(dāng)門靜脈血流量減少時肝動脈代償性擴張；反之，門靜脈血流增加時肝動脈血流量減少。門靜脈結(jié)扎而保留相應(yīng)肝動脈的完整通過肝動脈緩沖效應(yīng)從而有效的減低了門靜脈壓力，避免術(shù)后應(yīng)門靜脈壓力過高所導(dǎo)致的肝竇機械性灌注損傷。Kawasaki等[13]研究表明：PCNA的表達在評價肝再生有等同的價值，與本研究得出的結(jié)論相一致。

綜上所述，門靜脈結(jié)扎可以升高術(shù)后肝臟血流動力，并促進相關(guān)生長因子的表達，實現(xiàn)促進肝臟再生。但本實驗樣本量較少，在后續(xù)的實驗中將進一步擴大樣本量進行實驗。