交通空氣污染對大鼠子代發育及社交行為的影響

田宇，徐晨露，黃丹妮，馮鈺東，陳佳峰，劉晨陽，金永堂,*

1. 環境表觀遺傳實驗室，杭州 310058 2. 浙江大學醫學部，杭州 310058

隨著城市化進程的加快，全球空氣質量已不容樂觀，根據世界衛生組織的數據，全球91%的人口每天呼吸著受污染的空氣，而尾氣排放已成為空氣污染的主要原因[1]。交通尾氣成分非常復雜，主要有害物質包括細顆粒物、氮氧化物和二氧化硫等。這些污染物可以通過呼吸系統進入血液循環，透過血腦屏障進入大腦，造成炎癥反應和氧化應激損傷，引起中樞神經系統異常改變[2]。

自閉癥是一種神經發育障礙性疾病，主要表現為溝通困難、社交障礙和重復刻板行為。美國國家疾控中心數據顯示，自閉癥患病率從2012年的1.46%增長到2016年的2.47%[3]，但病因未明，且治療困難。Volk等[4-6]對美國加利福尼亞州的病例進行研究發現，母親懷孕期間和后代出生后第一年暴露于與交通有關的空氣污染、NO2、PM2.5和PM10與自閉癥有關。Kerin等[7]的調查顯示，孕早期NO2暴露劑量與兒童認知、適應能力評分呈負相關。Pagalan等[8]的研究指出，兒童自閉癥與母親孕期NO暴露有關(優勢比(OR)=1.07，95%置信區間(CI)=1.01～1.13)而與NO2和PM2.5無關?？偟膩碚f，在交通空氣污染與自閉癥關系的研究中，雖然有一些陰性結論[9]，但大部分研究結果都證明了二者的聯系[6,10-11]，也提示仍需要進一步實驗性研究來證明交通空氣污染與自閉癥的因果關聯。有研究利用動物實驗，采用柴油機顆粒物急性吸入的方式模擬交通空氣污染物暴露，研究結果顯示，動物出現了自閉癥樣改變，但模擬濃度較高，無法真實反映人群的尾氣暴露狀況[12]。

自閉癥病因機制未明，目前認為，除了遺傳因素外，受環境影響的組蛋白甲基化等表觀遺傳改變可能在調控大腦發育過程中發揮了關鍵作用。H3K4甲基化修飾作為一種染色質標志，廣泛參與許多生物學過程，包括異染色質的形成、X染色體失活和轉錄調控等，與基因表達激活有關[13]。H3K4甲基化異常會改變其與RNA聚合酶的結合狀態，影響DNA轉錄，進而引起大腦發育的改變，與神經發育和神經系統疾病有關[14]。有研究表明，一些與H3K4去甲基化相關的特異性酶發生基因突變與自閉癥有關[15-16]。此外，部分自閉癥患者腦組織中存在H3K4甲基化上調及分布范圍擴大，伴相應基因轉錄產物的表達異常，而這些基因通常與神經元連接、社會行為和認知功能有關[17-18]。值得注意的是，人類大腦皮質中的H3K4甲基化修飾從產前發育期間到幼兒期甚至青春期都是動態調節的[19]，可能會在與外界環境相互作用的過程中發生一些自閉癥相關的改變。

因此，本研究采用模擬人體生活環境的交通道路實地暴露方法，將Wistar孕鼠在整個孕期或窩鼠整個哺乳期分別置于校園對照區域、普通路段及城市主干道十字路口進行交通空氣污染物暴露，然后對其子代進行生長發育測量及行為學分析，通過更真實的人群生活環境來探索出生前后交通空氣污染暴露對大鼠自閉癥樣行為的影響，并分析出生前后暴露于交通空氣污染物與腦組織H3K4甲基化調控的關系，為深入認識自閉癥的危險因素、病因機制和預防措施提供思路。

1 材料與方法 (Materials and methods)

1.1 主要儀器材料

纖維濾膜(江蘇鹽城思銳儀器)，中等流量懸浮顆粒物采樣器(浙江恒達儀器，ZC-Q0101)，PM2.5-PM5-PM10-TSP切割器(浙江恒達儀器)，Any-maze動物行為分析系統(美國Stoelting公司)，總組蛋白提取試劑盒(美國Epigentek公司)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天公司)，總組蛋白H3K4甲基化定量檢測試劑盒(美國Epigentek公司)。

1.2 實驗動物

SPF級健康成年Wistar大鼠(上海斯萊克)，雌雄各36只，體重250～300 g。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物處理及分組

將Wistar大鼠雌雄1∶1合籠過夜，次日清晨檢查到陰栓的雌鼠認為交配成功，記為胚胎期第0天(E0)，產仔當天記為出生后第0天(P0)。根據暴露時間(胚胎期E、出生后P)和暴露濃度(低L、中M、高H)將受孕雌鼠隨機分為6組，每組6只，分別為EL、EM、EH、PL、PM和PH。

1.3.2 暴露地點與暴露裝置

根據交通車流量及城市道路等級，選擇浙江大學紫金港校區內某樹林作為低污染暴露組，選擇紫荊花北路(四車道)某點作為中污染暴露組，選擇城市主干道文一西路和古墩路交叉口作為高污染暴露組。暴露時，E組大鼠每2～3只一籠，妊娠晚期分籠；P組大鼠每窩一籠。各自放置于校園內、紫荊花北路路邊及十字路口路邊0.5～1.0 m高處進行暴露。暴露從清晨7:30開始到傍晚19:30結束，持續20 d(E1～E20、P1～P20)。出生后21 d(P21 d)斷奶，每組仔鼠中取雌雄各10只進行后續研究。

1.3.3 現場污染物監測

暴露期間，每天記錄杭州市氣象監測數據，包括天氣、氣壓、溫濕度、風力風向和空氣質量指數(Air Quality Index, AQI)，并從中選取7 d進行高峰期交通空氣污染物濃度的現場檢測，檢測指標包括NOx和PM2.5，每次監測持續1 h，各暴露點同時檢測。

1.3.4 生長發育測量

P25 d，對仔鼠稱重、測量身長后施安樂死，迅速解剖取腦組織稱重，將生物樣本編號并放于-80 ℃冰箱備用。

1.3.5 社交行為測試

P21 d斷奶后，從每組中選取雌雄各10只，送到浙江大學動物中心適應性飼養1～2 d，P22～P23 d進行三箱社交行為測試。三箱社交實驗是檢測社會交往能力的經典實驗，也是評價自閉癥動物模型時最常用到的行為測試[13]，如圖1。實驗包括3個階段：第一階段讓被測鼠在3個箱室內自由活動5 min以適應環境；第二階段隨機向其中一個籠子內放入陌生鼠1(Stranger 1)，讓被測鼠自由活動10 min，被測鼠對陌生鼠1或空籠(Empty)的嗅探時間(Sniffing times)及嗅探頻次(Sniffing frequencies)代表它的社交意向：社交能力正常的仔鼠傾向于接觸新朋友而非空籠；第三階段向籠內放入另一只陌生鼠2(Stranger 2)代表新朋友，陌生鼠1代表老朋友，通過記錄10 min內被測鼠與二者的接觸可評估其社交記憶能力及社交新穎性：通常情況下，大鼠具有探索及喜新厭舊的本性，更愿意接觸新鮮事物。測試結束后帶回實驗室，飼養于潔凈環境中。

1.3.6 組蛋白H3K4甲基化檢測

取仔鼠大腦皮質組織樣本0.2 g進行組蛋白提取，用BCA法測定蛋白濃度，之后根據總組蛋白H3K4甲基化試劑盒提供的方法定量檢測總組蛋白H3K4甲基化水平，記為H3K4me(ng·μg-1prot)=OD(樣品-空白)×1000/(蛋白量×斜率)。

1.4 統計學方法

數據采用SPSS 22.0統計分析。定量資料用均數±標準差表示。2組間比較采樣獨立樣本t檢驗或配對t檢驗，3組間比較采用單因素方差分析，多重比較用LSD法(方差齊)或蓋姆斯法(方差不齊)。P≤0.05為差異有統計學意義。

圖1 三箱實驗示意圖Fig. 1 Sketch map of three chambers test

2 結果(Results)

2.1 暴露現場空氣污染狀況

研究中選取的高濃度暴露點位于古墩路和文一西路交叉口，這2條道路均為杭州市區主干道，通常情況下每小時車流量為2 000～2 500次，高峰期可達3 500次以上，且經常出現交通擁堵及車輛怠速。中濃度暴露點位于紫金花北路，是城市輔助道路，通常情況下每小時車流量為800～1 000次，高峰期為1 500次以上。校園內清潔區域內樹木植被較多，通常情況下無車輛通行。圖2是杭州城市信息一點通網站公布的某日高峰期暴露地點周邊的車流量情況。

低、中和高濃度暴露點NOx(以NO2計)的1 h平均濃度均未超過國家衛生標準(GB3095—2012)，分別為(52.76±22.46)、(110.30±59.32)和(138.89±65.89) μg·m-3；方差分析有統計學意義(P<0.05)，兩兩比較顯示低、高濃度間存在差異(P<0.01)。暴露期間杭州市區NO2月平均濃度為44.5 μg·m-3。

PM2.5的1 h平均濃度在低、中和高濃度暴露點分別為(71.67±38.47)、(91.43±45.38)和(101.67±53.37) μg·m-3；組間差異無統計學顯著性(P>0.05)。暴露期間杭州市區PM2.5月平均濃度為45 μg·m-3。

2.2 子代一般體征和發育指標檢測

各組子鼠均未出現明顯異常，皮毛順滑，活動及飲食正常，雙眼無異常分泌物。出生后25 d，測量子鼠身長體重并施安樂死，剝離完整大腦并稱重計算臟器系數，生長發育指標見表1。胚胎期暴露于不同濃度的交通空氣污染對出生后體重、身長及大腦臟器系數均有影響(P<0.001)，對身體質量指數(Body Mass Index, BMI)無影響(P>0.05)；出生后暴露于不同濃度交通空氣污染對生長發育的影響均無統計學差異(P>0.05)。在中、低濃度水平下，出生后暴露組的體重、身長及BMI均低于胚胎期暴露組(P<0.001)，大腦臟器系數則高于胚胎期暴露組(P<0.001)；高濃度下雖然也出現這種趨勢，但差異并無統計學意義(P>0.05)。

2.3 社交能力檢測

交通空氣污染對各組仔鼠社交能力的影響如圖3所示。EL組接觸Stranger 1的頻次及時間均顯著大于空籠(P<0.01)，EM組接觸Stranger 1的頻次更高(P<0.05)而時間無差異(P>0.05)，EH組接觸Stranger 1和空籠的頻次及時間均無統計學差異(P>0.05)。方差分析顯示，胚胎期不同濃度組間對Stranger 1的嗅探時間及頻次均存在差異(P<0.01)，其中EH組的嗅探時間及頻次最低。PL、PM和PH各組接觸Stranger 1的頻次和時間均大于空籠(P<0.05)，但出生后不同濃度組間對Stranger 1和空籠的嗅探時間及頻次均無差異(P>0.05)。

圖2 某日高峰期暴露地點周邊的車流量情況Fig. 2 Traffic flow around exposure site in a daily peak period

在低、中濃度下，暴露時期不同對子代接觸Stranger 1和空籠的時間及頻次均無影響(P>0.05)。在高濃度下，胚胎期暴露組接觸Stranger 1的時間更短，差異有統計學意義(P<0.01)。

表1 子代一般發育指標Table 1 General developmental indicators of offspring

注：1為保留2位小數后分析方便，本文中顯示的是大腦臟器系數乘以100后的數值；2BMI為體重指數，為保留2位小數后分析方便，本文中顯示的是BMI×10的數值；與低濃度比較，*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001；與中濃度比較，#P<0.05、##P<0.01、###P<0.001；下同。

Note:1In order to facilitate analysis after reserving two decimal numbers, the value shown in this paper is the value of 100 times the coefficient of brain organs;2BMI is body mass index, in order to facilitate analysis after reserving two decimal numbers, the value shown in this paper is the value of 10×BMI; * compared with low concentration, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001; compared with medium concentration, #P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001; the same below.

圖3 交通空氣污染對仔鼠社交能力的影響注：EL、EM和EH分別表示胚胎期低濃度、胚胎期中濃度、胚胎期高濃度暴露，PL、PM和PH分別表示出生后低濃度、出生后中濃度、出生后高濃度暴露；下同。Fig. 3 Effects of traffic-related air pollution on social ability of offspringNote: EL, EM and EH stand for low, medium and high concentrations of exposure in the embryo, respectively, while PL, PM and PH stand for low, medium and high concentrations of exposure after birth, respectively; the same below.

2.4 社交記憶及新穎性檢測

交通空氣污染對各組仔鼠社交記憶及新穎性的影響如圖4所示。EL、EM組接觸Stranger 2的時間及頻次均高于Stranger 1(P<0.05)，EH組對二者的嗅探無差異(P>0.05)。方差分析顯示，不同濃度組對Stranger 1或Stranger 2的嗅探時間及頻次均無差異。PL組對Stranger 1和Stranger 2的嗅探存在差異(P<0.05)，PM、PH組對二者的嗅探均無差異(P>0.05)。不同濃度間對Stranger 1的嗅探時間及頻次隨濃度增加而遞增，對Stranger 2的嗅探遞減，但均無統計學差異(P>0.05)。相同濃度下，未見暴露時期對接觸Stranger 1或Stranger 2的頻次及時間的影響(P>0.05)。

2.5 組蛋白H3K4甲基化水平

采用酶聯免疫吸附法測定了各暴露組仔鼠腦皮質區的總組蛋白H3K4甲基化水平(圖5)。結果顯示，E組在各濃度下的H3K4甲基化未見統計學差異(P>0.05)，P組H3K4甲基化則出現濃度依賴性下調，但并無統計學意義(P>0.05)。在相同濃度下，P組H3K4甲基化顯著高于E組，差異有統計學意義(L,P<0.01; M,P<0.001; H,P<0.05)。

2.6 組蛋白H3K4甲基化水平與污染物相關性分析

分析了各組子代腦皮質區組蛋白H3K4甲基化與PM2.5、NOx濃度的相關性(表2)，均未發現統計學關聯(P>0.05)。

3 討論(Discussion)

本實驗進行期間，對杭州市區環境空氣質量及天氣狀況進行了記錄，并對暴露現場高峰期交通空氣污染物PM2.5、NOx濃度進行了抽樣，發現3個暴露點的污染物含量雖未超過國家標準，但呈現逐級遞增的趨勢，且均高于杭州市區平均值，最高濃度可達101.67 μg·m-3。主干道十字路口的NOx濃度顯著高于校園對照點(P<0.01)，最高濃度達138.89 μg·m-3，提示該區域交通尾氣污染嚴重。

圖4 交通空氣污染對仔鼠社交記憶及新穎性的影響Fig. 4 Effects of traffic-related air pollution on social memory and novelty of offspring

表2 組蛋白H3K4甲基化與污染物濃度的相關性Table 2 The correlation between histone H3K4 methylation and pollutant concentration

注：r表示相關系數，P表示顯著性水平。

Note:rmeans the correlation coefficient,Pmeans the significance level.

圖5 組蛋白H3K4甲基化水平Fig. 5 The level of histone H3K4 methylation

本研究中，雖然各組仔鼠在第一階段社交能力測試中，接觸同伴的時間均大于空籠，但胚胎期高濃度暴露組對二者的接觸沒有統計學差異，且仔鼠對同伴的接觸呈隨著濃度增加而減弱的趨勢；出生后暴露各組雖然對二者的選擇性接觸均有統計學差異，但對空籠的接觸呈隨濃度增加而增加的趨勢。這說明，生長發育階段接觸高濃度的交通空氣污染，尤其是胚胎發育期，會影響子代的社交能力。在第三階段社交記憶和社交新穎性的測試中，胚胎期暴露組接觸新朋友的時間均大于舊朋友，提示社交記憶良好，但高污染組對新、舊朋友的接觸無統計學差異，提示其社交新穎性受影響；出生后各組隨著暴露濃度增高，仔鼠接觸新朋友的時間遞減，接觸舊朋友的時間遞增，高濃度組接觸舊朋友的時間甚至超過新朋友，說明其社交記憶和社交新穎性受損。此前，Chang等[20]發現，小鼠宮內和早期生命發育過程中暴露于柴油廢氣污染(PM2.5約300 μg·m-3、6 h·d-1、5 d·week-1，等于時間加權濃度53 μg·m-3)會出現自閉癥樣行為缺陷，如交往和社會偏好測試中的社交能力降低，T-迷宮和大理石掩埋測試中的重復行為增加等。Yokota等[21]將孕鼠于妊娠期暴露于柴油廢氣環境中(90 μg·m-3、8 h·d-1)，發現后代雄性的攻擊性增強。Church等[22]將圍產期孕鼠暴露于PM2.5環境中(135.8 μg·m-3，全天)，發現幼仔社交能力下降，重復刻板行為增加。Thirtamara等[12]通過孕鼠及子代妊娠期柴油機顆粒物暴露(1 000 μg·m-3、4 h·d-1、5 d·week-1)，發現孕鼠產仔數、體重和健康狀態未受到影響；子代雖未出現明顯的社交障礙和溝通異常，但自我修飾、飼養和刻板行為增加，與孤獨癥患者的重復性/強迫行為類似。Li等[23]于雄鼠出生后8～22 d經鼻內滴注PM2.5(2或20 mg·kg-1，每天一次)，發現2組大鼠均表現出典型的孤獨癥行為特征，包括溝通障礙、社會交往不良和回避新奇等。綜合以上發現，再結合本次研究結果，可以推測城市交通主干道的汽車尾氣排放水平已經可以對生長發育階段的幼鼠產生不良影響，使其產生自閉癥樣行為。

細顆粒物粒徑小，可以通過呼吸系統入肺并沉積在肺泡，已被證實與心血管系統疾病、呼吸道疾病及癌癥有關。2016年全球PM2.5死因構成比達7.6%，死亡人口達420萬[1]。此外，PM2.5還可以隨著血液循環通過血腦屏障入腦[24]，或通過胎盤屏障進入胎兒體內[25]，造成DNA損傷或表觀遺傳異常[26-27]，引起氧化應激與膠質細胞激活等神經炎癥[28]，甚至造成幼鼠神經發育改變[29]。NOx是指有氮、氧2種物質組成的化合物，作為空氣污染指標的NOx主要包括NO和NO2，而NO在光照等條件下最終變成NO2，除了造成酸雨及臭氧層破壞，還與呼吸道疾病及自閉癥有關[30-32]。毒理[29,33-34]和病理研究[35-36]提示自閉癥的發病或與交通空氣污染物引起神經系統免疫應激及神經炎癥等毒性作用有關。這些交通空氣污染物引起的氧化應激和炎癥損傷會增加遺傳物質的不穩定性，可能通過與基因產生交互作用[5,37-39]以及表觀遺傳修飾的途徑影響蛋白質表達，進而誘導自閉癥[26,39]。

為了初步探討交通空氣污染物引起仔鼠出現自閉癥樣異常社交行為的潛在表觀遺傳機制，本研究檢測了各組仔鼠腦皮質區組蛋白H3K4甲基化的水平。結果顯示，在不同暴露濃度下，H3K4甲基化水平并未出現顯著差異。而Cantone等[40]發現，長期職業性接觸富含重金屬(鎳、砷和鐵)的顆粒物會引起工人血清H3K4甲基化水平上調。本研究中未發現H3K4甲基化水平與交通空氣污染物的關聯，可能是因為當地人群實際生活條件下的污染物濃度梯度尚不足以引起大鼠腦組織H3K4甲基化出現統計學上顯著的線性變化，也許還因為H3K4在體內不同組織區域內甲基化水平不一致有關。并且組蛋白修飾往往存在交叉對話，或與其他非組蛋白因素共同作用形成級聯修飾，使基因轉錄調節更加復雜多變，未來的研究可以將更多表觀遺傳效應納入研究中。此外，與胚胎期接觸交通空氣污染物相比，出生后暴露的仔鼠腦組織中H3K4甲基化水平更高，說明不同暴露時期交通空氣污染物對腦組織組蛋白H3K4甲基化的影響是有差異的。大腦各個功能區發育的窗口期出現及持續的時間不一樣，那么相應基因表達及修飾發生的時間也不同。之前研究表明[19]，大腦高級皮質區的發育與皮質轉錄組的廣泛變化有關，而H3K4甲基化作為轉錄調節的分子標志，其甲基化的快速增加或減少主要發生在妊娠晚期到出生后第一年，之后逐漸變緩，發育窗口期的外界環境刺激可能更容易影響基因的轉錄與翻譯。

本研究創新地模擬了人群交通空氣污染物自然吸入環境，構造的動物模型更接近于人體暴露條件，可以最大限度地還原真實環境。利用經典的社交評價模型——三箱試驗，可以根據社交溝通、社交記憶及社交新穎性來評估動物行為，證明本研究中交通污染路口暴露的動物確實出現了自閉癥樣行為，與此前幾項交通污染所致自閉癥動物模型結論一致，對自閉癥危險因素的研究有一定的參考意義。與此同時，本研究首次比較了不同暴露時期對腦組織H3K4甲基化水平的影響，為今后進一步探討自閉癥的表觀遺傳機制提供了線索。