金錢魚基因組微衛星分布特征分析及多態性標記開發

王耀嶸，楊 尉,2，任席林，江東能，鄧思平，陳華譜，朱春華，李廣麗

金錢魚基因組微衛星分布特征分析及多態性標記開發

王耀嶸1，楊 尉1,2，任席林1，江東能1，鄧思平1，陳華譜1，朱春華1，李廣麗1

（1. 廣東省名特優魚類生殖調控與繁育工程技術研究中心 // 廣東海洋大學水產學院，廣東 湛江 524088；2. 陽江職業技術學院 食品與環境工程系, 廣東 陽江 529566）

【目的】研究金錢魚()全基因組微衛星分布特征，篩選高多態性微衛星（SSR）標記。【方法】利用MISA軟件對金錢魚基因組中微衛星進行篩選并分析分布特征，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳和毛細管電泳篩選高多態性位點。【結果與結論】金錢魚基因組總共挖掘390 967個SSR位點，相對豐度為653個/Mb。二堿基重復類型最多（52.64%），微衛星標記整體偏向A+T堿基組合。篩選出23對多態性標記位點，其中7對的等位基因數為4 ~ 11，期望雜合度為0.431 ~ 0.859，觀測雜合度0.417 ~ 0.861，多態性含量為0.389 ~ 0.830。經Bonferroni校正后，5個位點符合哈德溫伯格平衡，且位點間不存在連鎖不平衡現象。

金錢魚；基因組survey測序；微衛星；標記開發

微衛星亦稱SSR（Simple sequence repeats）、短串聯重復序列（STR），是真核生物體以少數幾個核苷酸為單位、多次串聯重復的DNA序列。微衛星標記穩定、可靠，無組織差異，可快速、準確檢測且信息含量較高，已廣泛用于遺傳圖譜構建[1]、遺傳多樣性與遺傳結構分析[2-5]、物種/種質鑒定[6]、系統進化分析[7]和親緣關系鑒定[8]等方面。SSR標記開發引物設計時需準確的SSR位點保守側翼序列[9]。許多物種基因組非編碼區序列信息匱乏，限制了SSR標記開發。傳統的SSR標記開發方法有文庫法、富集法、省略篩庫法和種間共用引物法等[10]。這些方法操作較繁瑣，實驗周期長，所開發微衛星標記有效性及多態性偏低[11]。高通量測序技術(Next-generation Sequencing, NGS) 使非模式生物基因組和轉錄組信息大大增加，批量開發SSR標記成為現實。基于基因組測序結果篩選的SSR標記數量多，穩定性好，重復類型多，已成功用于石爬鮡(spp.)[12]、帶魚 ()[13]、竹?魚（）[14]、松江鱸（）[15]等多種魚類SSR標記的批量開發。

金錢魚（）又名金鼓魚，隸屬鱸形目（Perciformes）刺尾魚亞目（Acanthuroidei）金錢魚科（Scatophagidae）金錢魚屬（）。其營養價值高，味道鮮美，食性廣，抗病抗逆性強，鹽度適應范圍廣，是經濟價值較高的名特優養殖種類[16-21]。由于過度捕撈、環境污染、氣候變化等，我國金錢魚自然種群資源逐年減少，因此，加強種質資源開發與保護，保障金錢魚養殖業可持續發展有重要意義。目前，關于金錢魚分子標記開發等研究較少，SSR標記資源稀少，有效性和多態性偏低，難以支撐種群遺傳學深入研究。筆者通過基因組Survey測序構建的金錢魚基因組文庫尋找金錢魚基因組中SSR位點，開發類型豐富且多態性高的SSR標記，為金錢魚群體遺傳學研究提供多樣化和高分辨率分子標記，對金錢魚種質資源保護和利用有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗魚

實驗用金錢魚于2018年10月采自廣東省湛江市。經質量濃度為100 mg/L的MS-222麻醉后，取背部肌肉置于體積分數95%乙醇中保存。根據相關指導原則進行動物實驗并獲得廣東海洋大學水產學院動物研究與倫理委員會批準（201903004）。

1.2 金錢魚基因組

本課題組聯合諾禾致源公司完成金錢魚基因組Survey測序，基因組大小為598.73 Mb，原始數據上傳至SRA（Short Read Archive）數據庫(http://www. ncbi.nlm.nih.gov/sra/)，登錄號PRJNA559409。基因組提取及文庫構建參考Huang等[22]的方法。

1.3 金錢魚基因組微衛星標記分布特征

使用MIcroSAtellite（MISA）軟件從scaffolds序列中開發微衛星標記序列。查找要求為單核苷酸（Mono-）、二（Di-）、三（Tri-）、四（Tetr-）、五（Penta-）、六核苷酸（Hexa-nucleotides）重復序列的最小重復次數分別為10、6、5、5、5和5次[23]。分析微衛星序列的種類及所占比例。用primer 3軟件批量設計SSR引物，所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 SSR標記的開發

選擇10個金錢魚基因組DNA為模板，對隨機選擇50對SSR標記進行多態性檢驗，PCR反應體系為：12.5 μL 2×PCR Mix，0.5 μL 正反引物（10 μmol/L），1 μL DNA 模板（10 ~ 50 ng）和10.5 μL 雙蒸水。反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，52 ~ 62 ℃ 30 s（根據引物對應的TM值），72 ℃ 30 s，共25個循環；72 ℃ 5 min。PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測樣品擴增成功率，聚丙烯凝膠電泳統計多態性。選擇出現3條或以上特異性條帶位點。在篩選的標記中隨機選擇7對標記添加熒光接頭，在30個基因組樣本中擴增，擴增產物送至上海翼禾生物公司經毛細管電泳分型后用于后續分析。

1.5 數據分析

用Micro-Checker V.2.2.3軟件檢測無效等位基因（Null allele）。用Cervus 3.0.7分別計算每個位點的等位基因數（Number of allels，NA）、觀測雜合度（Observed homozygosity，o）、期望則合度（Expected homozygosity，e）、多態信息含量（PIC），用Genepop 4.3軟件檢驗位點間的連鎖不平衡及群體的哈德溫伯格（Hard-Weinberg，HWE）平衡。所有統計學檢驗的顯著性水平（= 0.05）均用Bonferroni法校正。

2 結果及分析

2.1 金錢魚各重復類型微衛星總體分布特征

金錢魚基因組共335 162條scaffold，有93 195條含有SSR位點，其中46 043條含有一個以上SSR位點。金錢魚基因組共挖掘390 967個SSR位點。不同重復類型中，二堿基重復類型最多，共205 789個，占比最高（52.64%），其次是單堿基（141 065個，36.08%）、三堿基（31 228個，7.99%）、四堿基（10 370個，2.65%）、五堿基（2 089個，0.53%），六堿基重復類型占比較少（426個，0.11%）。

2.2 不同微衛星堿基類型核心序列重復數分布

金錢魚基因組中不同類型的微衛星標記核心區重復數變化范圍從5 ~ 82拷貝不等，主要集中在5 ~ 24拷貝，占全部重復數范圍的98.84%。10拷貝的SSR數目最多，其次為6拷貝（圖1）。

單堿基SSR核心區重復數為10 ~ 82拷貝，主要集中在10 ~ 21拷貝，占單堿基SSR標記的96.27%，10拷貝的標記數目最多，共51 240個；二堿基微衛星核心區重復數6 ~68拷貝，集中在6 ~ 20拷貝，占二堿基微衛星標記的97.94%，6拷貝的標記數目最多，共46 343個；三堿基微衛星核心區重復數為5 ~ 28，集中在5 ~ 12拷貝，占三堿基微衛星標記的99.17%，5拷貝的標記數目最多，共14 700個；四堿基微衛星核心區重復數為5 ~ 25拷貝，集中在5 ~ 10拷貝，占四堿基微衛星標記的98.24%，5拷貝的標記數目最多，共6 041個；五堿基微衛星核心區重復數為5 ~ 24拷貝，集中在5 ~ 8拷貝，占五堿基微衛星標記的95.02%，5拷貝的標記數目最多，共1 176個；六堿基微衛星核心區重復數為5 ~ 12拷貝，集中在5 ~ 7拷貝，占六堿基微衛星標記的97.65%，5拷貝的標記數目最多，共302個（圖2）。

圖1 金錢魚基因組中微衛星重復數分布

A-B, 單堿基重復類型；C, 二堿基重復類型；D, 三堿基重復類型；E, 四堿基重復類型；F, 五堿基重復類型；G, 六堿基重復類型

A-B , Mononucleotide; C, Dinucleotide; D, Trinucleotide; E, Tetranucleotide; F, Pentanucleotide; G, Hexanucleotide

圖2 金錢魚基因組中各類型微衛星重復數分布

Fig. 2 Distribution of different copy numbers of various types of microsatellites ingenome

2.3 金錢魚重復堿基類型特征

金錢魚基因組中微衛星標記最多的重復類別是AC/GT，共155 982個，其次是A/T，共125 988個（圖3）。

圖3 金錢魚基因組中出現最多的10種SSR重復類別

單堿基重復類型中，A/T類別占絕對優勢。A/T堿基微衛星重復數共125 988個，占單堿基總數的89.31%；C/G堿基微衛星重復數共150 77個，占單堿基總數的10.69%；二堿基重復類型中，AC/GT堿基微衛星重復數最多，為155 982個，占二堿基總數目的75.80%，其次是AG/CT（17.86%）和AT/AT（6.27%）；三堿重復類型中，AGG/CCT堿基微衛星重復數最多，為8 104個，占三堿基總數的25.95%，其次是AAT/ATT（22.78%）和AAG/CTT（13.79%）；四堿基重復類型中，AGAT/ATCT堿基微衛星重復數最多，為2 112個，占四堿基總數的20.37%，其次是AAAT/ATTT（13.96%）和ACAG/CTGT（12.66%）；五堿基重復類型中，AGAGG/CCTCT堿基微衛星重復數最多，為317個，占五堿基總數的15.17%，其次是AAAAC/GTTTT（9.67%）和AAGAG/CTCTT（8.90%）；六堿基重復類型中，AATCAG/ATTCTG堿基微衛星重復數最多，為161個，占六堿基總數的37.79%，其次是AACCCT/AGGGTT（8.22%）和AAGAGG/CCTCTT（2.35%）（表1）。

表1 金錢魚基因組SSR中重復堿基優勢類別

2.4 金錢魚多態性標記的開發

隨機選擇50個SSR位點利用10份金錢魚基因組DNA擴增檢驗發現，41個位點有清晰的擴增產物，其中23個位點擴增產物有多態性，GenBank登錄號為MT110197 – MT110219（表2）。

表2 金錢魚23個多態SSR標記信息

表2續（Continued）

表3可見，7對標記SSR位點在30個金錢魚樣品中共檢測到58個等位基因，平均等位基因數為8.28，其中SA-SV-2位點的等位基因數最少（a= 4），SA-SV-1位點的等位基因數最多（a= 11）。期望雜合度為0.431 ~ 0.859，平均0.722；觀測雜合度為0.417 ~ 0.861，平均0.662。多態性含量為0.389 ~ 0.830，平均0.679。經Bonferroni校正后，SA-SV-3和SA-SV-5位點仍偏離哈德-溫伯格平衡，它們無效等位基因頻率（0.298 1、0.072 1）和近交系數（0.498 0、0.156 6）均較高。連鎖不平衡檢測表明，各位點間不存在連鎖不平衡現象。

表3 金錢魚7個多態SSR位點的遺傳學特征

注：*，經Bonferroni校正后顯著偏離哈德-溫伯格平衡（= 0.05）。

Note:*, Significant departure from Harder-Weinberg equilibrium after Bonferroni correction (= 0.05).

3 討論

3.1 金錢魚基因組微衛星分布特征

本研究共檢測到390 967個微衛星標記。在金錢魚6種完整的微衛星類型中，二堿基重復類型最多，占微衛星總數的52.64%，其次是單堿基重復類型，占總數的36.08%，其余4種重復類型占比較低，與紅鰭東方鲀()[24]、大菱鲆 ()[25]和日本囊對蝦（）[26]相似，而與美麗硬仆骨舌魚（）[27]及部分鲀類[23]的單堿基重復類型微衛星數占優勢的結果不同。

在單堿基重復類型中，A堿基在金錢魚微衛星堿基組成中占絕對優勢。在二堿基重復類型中，AC、AG、AT是二堿基重復類型中含量最高的三個類別，與紅鰭東方鲀[24]及人類（）[28]二堿基重復類型中排序一致。在三堿基重復類型中，AGG、AAT、AAG比例較高，其中AGG在三堿基重復類型中出現頻率最高，與紅鰭東方鲀、菊黃東方鲀（）、雙斑東方鲀（）和黑青斑河鲀（）相一致[23]。在脊椎動物中有類似報道[29-30]，但在魚類中這種分布特征并不常見。AGG是參與生物早期生長和發育轉錄因子的結合位點[31-32]。因此，AGG的高頻率分布可能在金錢魚早期生長調控、性別決定與分化中發揮重要作用。值得注意的是，在五堿基重復類型中，AGAGG是占比最高的類別。這與紅鰭東方鲀基因組微衛星統計分析結果一致，與其他魚類有較大差異。推測AGAGG類別可能在金錢魚進化及環境適應中有一定作用，重復類別與多種鲀類相似也預示金錢魚可能與紅鰭東方鲀親緣關系較近。微衛星標記中的優勢堿基表明，金錢魚基因組微衛星標記偏向A+T堿基組合，這一結果與諸多水生生物相同[33-36]。研究表明，物種基因組中微衛星標記數越多，A和T堿基所占比例越高。對于這一現象，Schl?tterer等[39]認為，基因組DNA由于甲基化的發生，胞嘧啶C容易脫氨基轉變成胸腺嘧啶T。基因組內GC含量少也是維持DNA熱力學穩定性的必要條件之一[40]。

金錢魚基因組微衛星核心區重復數為5 ~ 82拷貝，主要集中在5 ~ 24拷貝，并且隨著重復數的增加，各類別微衛星數目逐漸減少。這種現象普遍存在于多種生物的基因組微衛星中。究其原因，可能一方面由于微衛星長度增加，其穩定性降低；另一方面，微衛星重復數越高，突變率越高[41]。

3.2 金錢魚基因組微衛星標記的開發

金錢魚基因組中共獲得237 017個（95.01%）短堿基SSR（二堿基和三堿基），12 459個(4.99%) 長堿基SSR（四至六堿基）。Liu等[42]利用金錢魚轉錄組文庫篩選到5 676個短堿基SSR標記及258個長堿基SSR標記，梁鎮邦等[14]利用SLAF-Seq（Specific-Locus Amplified Fragment Sequencing）技術，在竹?魚基因組中共獲得39 080個短堿基SSR及4 184個長堿基SSR，向玲通[43]過磁珠富集法從金錢魚基因組中得到65條微衛星序列。由此可見，通過基因組survey測序篩選的SSR標記數量和類型更加豐富，表明基于高通量測序的基因組survey測序是更為快捷、高效的SSR標記分離方法。

本研究挑選的50個SSR位點中，有41個（82%）位點可擴增出1條以上的特異性條帶，有23個（56%）位點可擴增出3條或以上特異性條帶，表明金錢魚SSR標記開發成功率較高，本研究所獲取的249 902個二至六堿基重復的SSR標記有較高開發潛力，為金錢魚高多態性SSR標記的開發提供豐富的遺傳物質資源。

3.3 SSR標記的多態性及其遺傳學特征

本研究所選取的7個SSR標記位點在30個金錢魚樣品中共檢測到58個等位基因，平均等位基因數為8.28，高于Liu等[42]報道的金錢魚SSR標記平均等位基因數（4.17）。Botstein等[44]認為，多態信息含量高于0.5的標記為高多態性標記；小于0.5但高于0.25的為中度多態性標記；小于0.25的標記為低度多態性標記。本研究選取的7個標記中，僅有SA-SV-2為中度多態性標記，其余6個標記均為高度多態性標記。可見，本研究選取的微衛星標記多態性高，蘊含豐富的遺傳信息，可在金錢魚群體遺傳研究中為種質評估及種群遺傳多樣性水平鑒定提供良好的評價工具。

基因多樣性是評價群體遺傳變異的最適參數[45]。本研究群體的期望雜合度o為0.431 ~ 0.859，平均0.722；觀測雜合度e為0.417 ~ 0.861，平均0.662。分別高于Liu等[42]統計的金錢魚群體平均o（0.387）、e（0.398）以及DeWoody等[46]統計的32種魚類微衛星標記的平均o（0.63），表明本研究所選的金錢魚群體遺傳變異較高。經Bonferroni校正后，SA-SV-3和SA-SV-5位點仍偏離哈德-溫伯格平衡，顯示出雜合子缺失的現象。而這兩個位點近交系數(分別為0.498 0和0.156 6) 和無效等位基因頻率(分別為0.298 1和0.072 1) 較高，表明群體中存在的近交和無效等位基因是導致這兩個位點偏離哈溫平衡的主要原因。根據Chapuis等[47]提出的參照無效等位基因頻率劃分的微衛星標記三類標準，SA-SV-5標記（0.05≤ua＜0.20）屬于中頻無效等位基因位點，該類型位點可能使受測群體遺傳多樣性降低，并導致群體間遺傳距離和遺傳分化指數過高。因此，SA-SV-5位點在后續的金錢魚群體遺傳分析中應謹慎使用。而SA-SV-3標記（ua≥0.2）屬于高頻無效等位基因的位點，且顯著偏離哈德-溫伯格平衡，表明此位點不適于金錢魚后續遺傳分析。而其余5個具有高多態性、高雜合度、低頻無效等位基因的微衛星位點可作為金錢魚遺傳資源研究的可靠分子標記及優先選用標記。

4 結語

從基因組survey測序的結果來看，金錢魚基因組微衛星以二堿基重復類型及A+T堿基類別為主，微衛星核心區重復數主要集中于5 ~ 24拷貝，其中10拷貝最多。基于基因組survey測序，共檢測到249 902個二至六堿基重讀的SSR位點，為金錢魚高多態性SSR標記的開發提供豐富的遺傳物質資源。從50個SSR標記中成功開發出23個金錢魚多態性位點，7對隨機選擇的標記中，有5對符合哈溫平衡且遺傳信息含量高，可為金錢魚種質資源評估、群體遺傳多樣性分析及群體遺傳結構劃分提供有力的評價工具。

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Distribution Patterns of Microsatellites and Development of Polymorphic Markers fromGenome

WANG Yao-rong1, YANG Wei1,2, REN Xi-lin1, JIANG Dong-neng1, DENG Si-ping1, CHEN Hua-pu1, ZHU Chun-hua1, LI Guang-li1

（1.//,524088,; 2.,529566,）

【Objective】To develop highly polymorphic SSR markers and analyze the whole genome microsatellite distribution patterns in.【Methods】The MIcroSAtellite (MISA) identification software was employed in data mining and isolate the microsatellites loci in. Microsatellite polymorphism was explored by capillary electrophoresis and polyacrylamide gel electrophoresis.【Result and Conclusion】A total of 390967 microsatellites loci were identified in the genome of, with a relative abundance of 653 per Mb. Among the 1 to 6 different base repeat types of microsatellites, the number of two base repeats was the highest, and the A+T were the most frequent microsatellite classes. A total of 23 pairs of polymorphic markers were identified from the screening, and capillary electrophoresis was performed on 7 of them. The number of alleles per locus ranged from 4 to 11. The expected and observed heterozygosity ranged from 0.431 to 0.859 and from 0.417 to 0.861, respectively. The polymorphism information content ranged from 0.389 to 0.830. After Bonferroni correction, five loci were consistent with the Hardy-Weinberg equilibrium and showed no linkage disequilibrium.

; genome survey sequencing; microsatellite; SSR mining

Q78；Q959.483

A

1673-9159（2020）04-0007-08

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.04.002

2020-02-28

國家重點研發計劃“藍色糧倉科技創新”重點專項（2018YFD0901203）；廣東省自然科學基金（2019A1515010958、2019A1515012042）；廣東省科技廳科技創新戰略專項重點項目（2018B030311050）；廣東省普通高校青年創新人才項目（2017GKQNCX092）

王耀嶸（1995―），男，碩士研究生，研究方向為魚類群體遺傳學。yaorongwang217@126.com

李廣麗（1967―），女，教授，博士，研究方向為魚類生理與繁殖。guangligdou@163.com

王耀嶸，楊尉，任席林，等. 金錢魚基因組微衛星分布特征分析及多態性標記開發[J]. 廣東海洋大學學報，2020，40(4): 7-14.

（責任編輯：劉慶穎）