石斑魚頭酶解產物的制備及其功能性質

范秀萍，徐 杰，林澤安，湯宴熙，李子青，江彩珍，蘇偉明

石斑魚頭酶解產物的制備及其功能性質

范秀萍1,2，徐 杰1，林澤安1，湯宴熙1，李子青1，江彩珍1，蘇偉明1

（1. 廣東海洋大學食品科技學院// 廣東省水產品加工與安全重點實驗室// 廣東省海洋食品工程技術研究中心// 水產品深加工廣東普通高等學校重點實驗室，廣東 湛江 524088；2. 南方海洋科學與工程廣東省實驗室，廣東 湛江 524088）

【目的】為了提高石斑魚加工副產物的生物價值，對石斑魚頭中抗氧化活性物質進行分離與功能性質分析。【方法】以珍珠龍膽石斑魚頭為原料，采用生物酶解法，以水解度和DPPH自由基清除率為指標，通過單因素試驗和響應面法優化酶解工藝；酶解產物經不同分子質量的超濾膜進行分離，對分離各級分的體外抗氧化活性與功能性質進行研究。【結果】石斑魚頭酶解產物的最佳制備條件是：風味蛋白酶添加量3 000 U/g，在pH 7.0，酶解溫度為45 ℃、底物質量濃度300 mg/mL下酶解4.5 h，得到的石斑魚頭粗酶解產物的水解度為（20.27 ± 1.28）%。分子質量< 3 ku的酶解產物（EHH-1）蛋白質質量分數為（13.18 ± 1.17）%，抗氧化活性最顯著，其對DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基清除作用的IC50值分別為0.35、4.60、0.46 mg/mL；在pH4.0~ 8.0之間均具有較好溶解性，氮溶指數達到（75.08~ 87.50）%，熱穩定性達到（70.00~ 82.00）%，乳化活性為（23.52~ 37.45）m2/g。【結論】石斑魚頭酶解產物分子質量<3 ku的超濾級分具有較強的抗氧化性與良好的功能性質，在天然抗氧化劑和食品加工領域有潛在的利用價值。

石斑魚頭；酶解；自由基清除；功能性質

石斑魚()，屬鱸形目鮨科，主要生長于溫海水帶區域。目前在石斑魚的養殖繁育、疾病的預防治療及遺傳育種等方面取得了一定的成果[1-2]。石斑魚口感滑嫩、營養豐富、肉質鮮美，具有經濟價值高、環境適應力強、易飼養、生長速度快等特點[3]，已成為我國海水養殖的主要品種。

目前石斑魚主要以食用鮮活產品為主要消費方式，其保活、保鮮技術是目前研究的主要方向[3-4]。另外，隨著養殖產量的增加，石斑魚的加工及其加工副產物的開發應用也逐漸引起人們的關注[5]。魚頭是加工過程主要的副產物，石斑魚的魚頭占全魚質量比約為10%[6]。筆者以石斑魚頭為研究對象，采用生物酶解技術探討魚頭中的活性成分物質，并對其功能性質進行分析，以期為石斑魚的高值化利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

珍珠龍膽石斑魚（），購于廣東湛江霞山水產品批發市場。取魚頭清洗后，經高速組織搗碎機搗碎混勻后，用保鮮袋分裝于-20 ℃冷凍備用。

風味蛋白酶（酶活力為18×104U/g）、動物蛋白酶（酶活力23×104U/g）、中性蛋白酶（酶活力20×104U/g）、堿性蛋白酶（酶活力15×104U/g）、木瓜蛋白酶（酶活力為21×104U/g）均購自廣西南寧東恒華道生物科技有限責任公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）購自上海源葉生物科技有限公司；其他試劑，均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

DS-1型高速組織搗碎機，上海標本模型廠；HHS型電熱恒溫水浴鍋，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；pHS-3C型pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；BSA224S-CW型萬分之一電子天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；Mini pellicon型超濾裝置，默克密理博試驗室設備(上海)有限公司；5810R型臺式高速大容量冷凍離心機，德國艾本德股份公司；GZX-9240MBE型電熱鼓風干燥機，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；Varioskan Flash酶標儀，美國賽默飛世爾科技公司；FD-551冷凍干燥機，上海愛朗儀器有限公司；Vapodest凱氏定氮儀，德國Gerhardt；SZF-06A型脂肪測定儀，上海洪紀儀器設備有限公司；HX204型鹵素水分測定儀，梅特勒-托利多；N-1100V-WB型旋轉蒸發儀，上海愛朗儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 魚頭酶解工藝流程 依次為珍珠龍膽石斑魚頭搗碎混勻，按料水比加入蒸餾水，調pH，酶解，100 ℃滅酶10 min，冷卻，4 000 r/min離心10 min，取上清液，測定水解度和自由基清除率。

1.3.2 一般營養成分的測定 水分：鹵素水分測定儀測定(GB 5009.5-2016)；粗脂肪：索氏抽提法（GB 5009.6-2016）；粗蛋白：凱氏定氮法（GB 5009.5-2016）。

1.3.3 酶解條件的篩選

1.3.3.1 蛋白酶的選取 取魚頭20 g，分別加入

4 000 U/g的風味蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、動物蛋白酶，在最適pH 7.0（堿性蛋白酶pH為8.0）及溫度為50 ℃，底物質量濃度250 mg/mL（魚頭與水的質量體積比），酶解4 h，測得水解度（DH）及DPPH自由基清除率，選取合適的酶。

1.3.3.2 單因素試驗

（1）酶添加量對水解度和DPPH自由基清除率的影響：選取風味蛋白酶，在pH 7.0、50 ℃、底物質量濃度250 mg/mL條件下酶解4 h，設置不同酶添加量（1 000、2 000、3 000、4 000、8 000 U/g），分別測得水解度及DPPH自由基清除率，考察酶添加量的影響。

（2）底物質量濃度對水解度和DPPH自由基清除率的影響：選取風味蛋白酶，酶添加量3 000 U/g，在pH 7.0、50 ℃條件下酶解4 h，設置不同底物質量濃度（100、125、250、500、1 000 mg/mL)，分別測得水解度及DPPH自由基清除率，考察底物質量濃度的影響。

（3）pH對水解度和DPPH自由基清除率的影響：選取風味蛋白酶，酶添加量3 000 U/g，在50 ℃、底物質量濃度250 mg/mL條件下酶解4 h，設置不同pH（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0），分別測得水解度及DPPH自由基清除率，考察pH的影響。

（4）酶解時間對水解度和DPPH自由基清除率的影響：選取風味蛋白酶，酶添加量3 000 U/g，在pH 7.0、50 ℃、底物質量濃度250 mg/mL條件下酶解，設置不同酶解時間（2、3、4、6、8 h），分別測得水解度及DPPH自由基清除率，考察酶解時間的影響。

（5）酶解溫度對水解度和DPPH自由基清除率的影響：選取風味蛋白酶，酶添加量3 000 U/g，在pH 7.0、底物質量濃度250 mg/mL條件下酶解4 h，設置不同溫度（40、45、50、55、60 ℃），分別測得水解度及DPPH自由基清除率，考察酶解溫度的影響。

1.3.3.3 Box-Benhnken中心組合試驗設計 在單因素試驗的基礎上，固定酶解pH 7.0，每個因素選取3個對水解度影響較大的水平，建立四因素三水平的Box-Benhnken中心組合試驗[6]，分別以水解度和DPPH自由基清除率為響應值，各因素的三個水平采用-1、0、1進行編碼，如表1。

表1 Box-Benhnken試驗因素水平設計

1.3.4 水解度的測定 原料總氮含量用凱式定氮法（GB 5009.5-2016）測定；酸度計法（GB 5009.235-2016）測定樣品中的氨基態氮含量。計算公式如下：

水解度（%）=（水解液中的氨基態氮－原料中游離的氨基態氮）/（原料中的總氮－原料中的非蛋白氮）。

1.3.5 酶解產物的超濾分離與抗氧化活性評價 分別以8 ku、5 ku、3 ku的超濾膜對石斑魚頭酶解產物（Einephelus head hydrolysate, EHH）進行超濾分離，濃縮后冷凍干燥分別得到分子質量>8 ku（EHH-4）、5 ~ 8 ku（EHH-3）、3 ~ 5 ku（EHH-2）和< 3 ku（EHH-1）級分。

采用DPPH自由基法[7]、FeSO4-水楊酸法[8]、鄰苯三酚自氧化法[9]對石斑魚頭酶解產物與超濾級級分的體外抗氧化活性進行評價。

1.3.6 石斑魚頭酶解產物功能性質的研究 參考文獻[10-12]，分別以氮溶指數（%）、熱穩定性（%）和乳化活性（m2/g）為指標對石斑魚頭酶解產物與超濾級分的溶解性、熱穩定性及乳化性進行分析。雙縮脲法測定上清液蛋白質含量。

1.3.7 數據處理 采用MS Excel 2010軟件作圖，Design-Expert 8.0.5b軟件進行響應面優化分析；采用IC50計算軟件計算IC50值。

2 結果與分析

2.1 一般營養成分

石斑魚頭的一般營養成分：以濕基計，原材料中的粗蛋白質量分數為（15.13 ± 0.28）%，粗脂肪質量分數為（3.45 ± 0.05）%。與蘇紅等[13]報道相比，石斑魚頭粗蛋白的含量高于鳙魚和三文魚頭，略低于金槍魚頭，而粗脂肪含量均低于上述三種魚頭。石斑魚頭可作為一種高蛋白含量加工副產物進行利用。

2.2 酶解工藝優化

2.2.1 蛋白酶的篩選 從圖1可以看出，風味蛋白酶的水解度最高，達到15.8%。除了動物蛋白酶，其余4種蛋白酶酪解產物的DPPH自由基清除率達到80%以上，綜合考慮，選擇風味蛋白酶為本試驗酶解用酶。王雪芹等[14]發現風味蛋白酶對鮐魚也有較好的酶解作用，說明風味蛋白酶是一種良好的水產魚類水解作用酶。

圖1 不同蛋白酶對水解度和DPPH自由基清除率的影響

2.2.2 單因素試驗

2.2.2.1 酶添加量的影響 從圖2可見，隨著酶添加量的增加，水解度不斷上升，當酶加量為3000 U/g時，水解度達到最大值，此時魚頭蛋白基本與酶結合飽和，即使酶添加量增加，其水解度也趨于平緩。隨著水解度的上升，DPPH自由基清除率呈現波動趨勢，但在3 000 U/g酶添加量時水解度達到16.1%，與4 000 U/g酶添加量時水解度（15.8%）差異不明顯，且DPPH自由基清除率達到90.2%。因此，選擇酶添加量為3 000 U/g進行后續試驗。

圖2 酶添加量對石斑魚頭水解度與DPPH自由基清除率的影響

2.2.2.2 底物質量濃度的影響 從圖3可見，當底物質量濃度逐漸增大時，水解效果緩慢上升，但當底物質量濃度大于250 mg/mL時，水解效果下降，這是因為當底物質量濃度達到一定程度時，已無蛋白酶再與底物結合生成中間產物，酶促反應達到極限。綜合考慮，選擇底物質量濃度為250 mg/mL。

圖3 底物質量濃度對石斑魚頭水解度與DPPH自由基清除率的影響

2.2.2.3 pH值的影響 從圖4可見，當pH值從6.0增大至7.0時，pH值對石斑魚頭的酶解效果逐漸遞增，在pH 7.0~ 8.0范圍內，pH值對石斑魚頭的酶解效果逐漸降低。由于風味蛋白酶是一種中性高活性蛋白酶，當pH值為7.0時，pH對石斑魚頭的酶解效果達到最大。因此，選擇pH值為7.0。

圖4 pH值對石斑魚頭水解度與DPPH自由基清除率的影響

2.2.2.4 酶解時間的影響 從圖5可見，隨著酶解時間增加，酶解時間對石斑魚頭水解效果的影響在提升；當酶解時長超過4 h，酶解時間對石斑魚頭水解效果的影響呈下降趨勢。洪鵬志等[15]發現，當酶解時間超過4 h之后，酶解效果趨于平緩。本試驗結果與之一致，故選擇酶解時間為4 h。

圖5 酶解時間對石斑魚頭水解度與DPPH自由基清除率的影響

2.2.2.5 酶解溫度的影響 從圖6可見，最佳酶解溫度為50 ℃。隨著溫度的升高，溫度對石斑魚頭的酶解效果明顯上升，當酶解溫度超過50 ℃時，由于蛋白酶逐漸失活，反應速度變慢，溫度對石斑魚頭的酶解效果降低。因此，選擇溫度為50 ℃。

2.2.3 BBD試驗結果與數據分析

2.2.3.1 BBD試驗設計方案及結果 根據單因素試驗結果，利用Design-Expert 8.0.5b軟件設計出試驗方案及試驗結果，如表2所示。以水解度和DPPH自由基清除率為響應值，以風味蛋白酶酶添加量1、酶解溫度2、底物質量濃度3、酶解時間4為自變量，建立四因素三水平中心組合試驗設計，共包括29組試驗方案，其中24組析因試驗點，5組中心試驗點，用以計算試驗誤差。

圖6 酶解溫度對石斑魚頭水解度與DPPH自由基清除率的影響

表2 Box-Benhnken試驗設計與結果

表2續（Continued）

2.2.3.2 回歸方程擬合及方差分析 通過Design-

Expert 8.0.5b軟件分析，回歸分析結果見表3。以水解度為指標，對各因素回歸擬合后，得出回歸方程：

= 11.85－0.321－1.892+ 1.413－3.604+ 0.5412－0.4613－0.7314－2.1623－1.8624+ 0.5834－3.5712－2.3122－1.1532－0.8242+ 2.08122－1.75123－4.33124+ 1.49122－0.39132+ 0.75232－0.96224+ 1.38232。

由表3可知，該模型的2= 0.990 4，模型整體達極顯著水平（< 0.001），失擬項不顯著（= 0.193 3>0.05），說明該模型與實際擬合較好，試驗方法可靠，自變量與響應值之間線性關系顯著，所得方程與實際擬合中非正常誤差占比小，所以可用該模型來分析與預測珍珠龍膽石斑魚頭抗氧化活性肽的酶法制備工藝效果。同時，矯正決定系數2adj= 0.955 0 > 0.8，變異系數CV= 7.71%，進一步說明模型擬合程度較好，模型能較好地反映真實的試驗值。由各因素的均方值可知，各因素對水解度的影響順序為：酶解時間>酶解溫度>底物質量濃度>酶添加量。酶解時間、酶解溫度和底物質量濃度的一次項和二次項對水解度均有顯著影響（< 0.05)。

表3 以水解度為響應值的回歸模型方差分析

表3續（Continued）

以DPPH自由基清除率為響應值進行回歸分析（表4），模型整體不顯著（= 0.136 5 > 0.05），失擬項不顯著（>0.05），因此選取以水解度為值的模型用于試驗。

表4 以DPPH自由基清除率為響應值的回歸模型方差分析

2.2.3.3 響應面的交互作用分析 根據Design-Expert 8.0.5b軟件，獲得響應值的3D曲面，分析各因素對水解度的影響及各因素間的交互作用，如圖7~ 9。響應面圖等高線的形狀反映交互作用的強弱，圓形表示兩因素交互作用不明顯，而橢圓則表示交互作用明顯[16-17]。如圖7、8均可看到，在固定其中一個因素后，另一因素對水解度的影響呈先逐漸增加后逐漸減少的趨勢。在達到響應曲面最高點時即為水解度的最佳值。投影對應下的等高線圖即為橢圓的中心點，此時對應為酶解的最佳條件。如圖9，酶添加量和時間對水解度的交互作用不是很明顯，其投影的等高線圖為未閉合的弧線，但還是可見其有先增加后減少的趨勢，固定酶添加量，可見時間變化的后期趨于平緩，根據效益原則，也可得出最佳交互條件。

圖7 兩因素的交互作用的響應面

Fig. 7 Response surface plots of variable parameters

2.2.3.4 響應面模型驗證 根據Box-Benhnken試驗所得數據，利用Design-Expert 8.05b軟件分析，可得最佳的工藝條件為：酶添加量2 989 U/g（原料）、酶解溫度為45.67 ℃、底物質量濃度297.73 mg/mL、時間4.5 h，在此條件下預測的水解度為17.54%。為方便試驗操作，將風味蛋白酶添加量定為3 000 U/g、酶解溫度為45 ℃、底物質量濃度300 mg/mL、時間4.5 h。平行3次測得的水解度為（20.27 ± 1.28）%，高于理論值，說明采用響應面法優化石斑魚頭肽酶解工藝參數可行。

2.3 魚頭酶解產物的抗氧化活性

由表5可見，石斑魚頭酶解產物EHH-4（>8 ku）超濾級分中粗蛋白質量分數最高，達22.27%，但EHH有較強的DPPH自由基清除作用，IC50值接近于對照組VC；EHH-1（<3 ku）的超濾級分顯示出最好的體外清除羥基和超氧陰離子自由基作用。趙忠強等[9]以秋刀魚為原料制備蛋白酶解液，發現1~ 3 ku級分具有較強的抗氧化性，與本試驗結果一致。

表5 石斑魚頭酶解產物的蛋白質含量與抗氧化活性

2.4 功能性質研究

2.4.1 溶解性和熱穩定性 通常，溶解性較高是蛋白質其他功能性質的前提。酶解產物溶解性效果見圖8，從圖8可見，EHH-1、EHH-2、EHH-3和EHH在各pH條件下溶解性均較佳，其中粗酶解產物溶解性最佳，在pH 4.0~ 8.0時，氮溶指數均達到80%以上。分子質量>8 ku級分（EHH-4）的氮溶指數低于其它級分，分子質量<3 ku（EHH-1）級分的氮溶指數在pH 4.0~ 8.0范圍內達75.08%~ 87.50%。蛋白質經酶解后多肽鏈被切斷，小肽含量增加，暴露的極性基團較多，親水性加大，從而使蛋白質溶解性提高。pH 4.0條件下各酶解產物溶解度普遍低于pH 7.0時各酶解產物溶解度，與石斑魚頭酶解產物等電點在pH4.0左右有關，當pH值為等電點時，蛋白質分子呈中性，與水分子的反應程度最小，蛋白質分子相互聚集，此時溶解性降低。

圖8 石斑魚頭酶解產物的溶解性

酶解產物的熱穩定性效果見圖9，從圖中可以看出，EHH-1、EHH-2、EHH-3在各pH條件下熱穩定性都在60%以上，說明EHH-1、EHH-2、EHH-3在各pH條件下具有較好的熱穩定性，且其他各超濾級分相較于其未加熱處理時的溶解性都變化不大，甚至一些級分還有所提高，這是因為蛋白質分子經水解后肽鏈展開，更易與水分子形成氫鍵，親水－疏水平衡得到改善，經熱處理后酶解產物仍可保持較高的溶解性[18]。這與李利敏[19]對羅非魚酶解超濾液進行研究，最終得出5 ku透過液、3 ku透過液和1 ku熱穩定性最佳的結果一致。

圖9 石斑魚頭酶解產物的熱穩定性

2.4.2 乳化性 酶解產物的乳化效果見圖10，隨著pH值的增大，各酶解產物的乳化性逐漸遞增，其中以EHH-1、EHH的增長速度較為顯著，可見EHH-1的乳化活性為23.52~ 37.45 m2/g。而EHH-3、EHH-4的乳化性較弱，可能是由于超濾分級之后，小分子肽間的會出現強交互作用，降低蛋白表面黏度[20]，造成EHH-3、EHH-4的乳化性低于EHH，而隨著分子量進一步的減小，蛋白溶解度增加，從而乳化性又有所提高[21]，所以EHH-1的乳化性高于EHH-3、EHH-4。

圖10 石斑魚頭酶解產物的乳化性

3 結論

珍珠龍膽石斑魚是一種養殖產量巨大的海水經濟魚類，其加工副產物石斑魚頭中含粗蛋白15.13%，是一種優質的蛋白源。本研究通過單因素試驗，響應面優化設計后的工藝條件為：pH=7.0，酶添加量3 000 U/g、溫度為45 ℃、底物質量濃度 300 mg/mL、時間4.5 h，得出石斑魚頭粗酶解產物（EHH）的水解度為（20.27 ± 1.28）%。石斑魚頭粗酶解產物（EHH）經過不同分子質量的超濾膜分離后得到的石斑魚頭不同分子質量范圍的酶解產物，分子質量<3 ku的酶解產物（EHH-1）蛋白質含量為13.18%±1.17%，對DPPH自由基清除率、超氧陰離子自由基清除率和羥自由基清除率最佳，IC50值對應為0.35、0.46、4.60 mg/mL。石斑魚頭粗酶解產物及分子質量<8 ku的酶解產物的溶解性較好；分子質量<8 ku的酶解產物具有較好熱穩定性；石斑魚頭粗酶解產物（EHH）和分子質量<3 ku的酶解產物(EHH-1)都具有良好的乳化性。石斑魚頭分子質量<3 ku的酶解產物（EHH-1）具有較強的抗氧化活性與良好的溶解性、熱穩定性和乳化性，在食品加工業與天然抗氧化劑的開發利用中具有潛在應用價值。

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Preparation and Functional Properties of Enzymatic Hydrolysis Products of Grouper Head

FAN Xiu-ping1,2, XU Jie1, LIN Ze-an1, TANG Yan-xi1, LI Zi-qing1, JIANG Cai-zhen1, SU Wei-ming1

（1.,////,,524088,; 2.,524088,）

【Objective】To improve the biological value of the processing by-products of grouper, the antioxidant active substances in the head of grouper were separated and were used to analyzed the functional properties.【Method】The pearl gentian grouper head was used as raw material during the bio-enzymatic processing. Hydrolysis degree and DPPH free radical scavenging rate were used as indexes. The optimum conditions for the enzymatic hydrolysate of the grouper head by single factor test and response surface method. The enzymatic hydrolysis products were graded by ultrafiltration membranes with different molecular weight sizes. The antioxidant activity in vitro and functional properties of enzymatic hydrolysis products were studied. 【Result】The grouper head was hydrolyzed by the flavor protease with the amount of 3000 U/g, at 45 ℃ and pH 7.0, 300 mg/ml substrate concentration, for 4.5 h. The degree of hydrolysis of the crude enzymatic hydrolysate of the grouper head was (20.27 ± 1.28) %. The enzymatic hydrolysates with molecular weight lower than 3 ku(EHH-1) had the (13.18 ± 1.17) % protein content, and higher antioxidative activity, with the IC50values of scavenging effect to DPPH radicals, hydroxyl radicals, and superoxide free radicals were 0.35 mg/mL, 4.60 mg/mL, and 0.46 mg/mL, respectively. Furthermore, under the pH range of 4.0-8.0, EHH-1 showed good functional properties, with the Nitrogen solubility index (NSI) reached (75.08－87.50) %, thermal stability of (70.00－82.00) %, emulsifying activity of (23.52－37.45) m2/g. 【Conclusion】Hyperfiltration fraction of molecular weight <3 ku of grouper head enzymatic hydrolysis product showed strong antioxidant activities and good functional properties, which had potential utilization value in the field of natural antioxidants and food processing.

grouperhead; enzymatic hydrolysis; free radical scavenging; functional properties

TS218

A

1673-9159（2020）04-0090-10

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.04.013

2019-12-30

南方海洋科學與工程廣東省實驗室（湛江）資助項目（ZJW-2019-06）；廣東省大學生創新創業訓練計劃資助項目（S201810566063）

范秀萍(1979－)，女，講師，主要研究方向為水產品保活流通與加工。E-mail: fanxp08@163.com