環(huán)境響應(yīng)性自組裝多肽水凝膠的研究進(jìn)展

戴江東

（建湖縣人民醫(yī)院門診中藥房，江蘇鹽城 224700）

0 引言

水凝膠是一種由物理或化學(xué)方式相互交聯(lián)且在水中可以發(fā)生膨脹的三維網(wǎng)絡(luò)體系。在20世紀(jì)50年代末，Wichterle和Lim首次合成了聚（2-羥乙基甲基丙烯酸酯）水凝膠，自此之后，由不同結(jié)構(gòu)和不同理化性質(zhì)的天然或合成聚合物所制備的水凝膠被廣泛應(yīng)用于藥物遞送系統(tǒng)［1］。環(huán)境響應(yīng)性水凝膠是其中一類能夠?qū)Νh(huán)境刺激做出相應(yīng)變化的新型水凝膠，即當(dāng)受到外界一些物理或化學(xué)條件的刺激時(shí)，凝膠會(huì)發(fā)生溶脹、收縮、降解或是從凝膠向溶膠轉(zhuǎn)換等變化［2］。環(huán)境響應(yīng)性水凝膠不但具有良好的吸水性、保水性以及可降解性等傳統(tǒng)水凝膠的特點(diǎn)外，還具有優(yōu)良的控釋性、生物相容性、生物黏附及環(huán)境敏感性等優(yōu)點(diǎn)，從而在各個(gè)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，是一類極具開發(fā)潛力的高分子材料［3-4］。

環(huán)境響應(yīng)性多肽水凝膠，因?yàn)槠淇山到庑浴⑸锵嗳菪约昂铣傻亩鄻有缘葍?yōu)點(diǎn)在藥物研究領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。本文著重從環(huán)境響應(yīng)性、自主裝多肽以及凝膠形成機(jī)制這3個(gè)方面進(jìn)行介紹。

1 環(huán)境響應(yīng)性

環(huán)境響應(yīng)性水凝膠根據(jù)其環(huán)境響應(yīng)性主要分為pH響應(yīng)性、溫度響應(yīng)性、光響應(yīng)性、氧化還原響應(yīng)性等［5］。

1.1 pH響應(yīng)性水凝膠

具有pH敏感的水凝膠可以對(duì)不同的pH值產(chǎn)生不同的反應(yīng)，這一特點(diǎn)常被應(yīng)用于藥物遞送系統(tǒng)中。蛋白和多糖類生物物質(zhì)是較常用的pH響應(yīng)性水凝膠材料，如提取于闊莢合歡種子的水溶性多糖（Polysaccharides of Albizia lebbeck L，ALPS）是一種非離子多糖，可用于制備pH敏感的藥物遞送材料［6］。Qu等［7］將n-羧乙基殼聚糖（CEC）添加至聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）中形成可用于包裹阿霉素（DOX）的具有抗腫瘤活性的水凝膠體系，且CEC與PEGDA均具水溶性，因而在制劑制備工藝中無(wú)須釆用有機(jī)溶劑。與傳統(tǒng)制劑相比，該包裹DOX的半固體水凝膠制劑具有良好的可注射性與pH響應(yīng)性，當(dāng)注射入腫瘤部位后，在腫瘤微環(huán)境的刺激下持續(xù)緩慢地釋放出抗腫瘤藥物并減少不良反應(yīng)，在藥物遞送領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。

1.2 溫度響應(yīng)性水凝膠

溫度響應(yīng)性水凝膠能在溫度改變時(shí)產(chǎn)生相應(yīng)的溶脹、收縮或降解等行為。在過(guò)去的10年里，可注射的溫敏材料已經(jīng)被研究用于修復(fù)各種病變的器官、組織及細(xì)胞等，如一些溫敏聚合物材料被以微創(chuàng)的方式注射入體內(nèi)，受到溫度變化的刺激時(shí)，可以通過(guò)幾種非共價(jià)的連接，誘導(dǎo)聚合物鏈之間的可逆交聯(lián)，從而發(fā)揮對(duì)環(huán)境變化的響應(yīng)作用。Wu等［8］用聚乙二醇和聚磷酸乙酯組成的三嵌段共聚物制備成可以包載抗腫瘤藥物DOX的溫敏納米水凝膠，通過(guò)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞（A549）對(duì)DOX的攝取實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該載藥的納米水凝膠的細(xì)胞攝取率較高，細(xì)胞毒性較強(qiáng)，說(shuō)明該溫度敏感型水凝膠是較好的藥物遞送材料。

1.3 光響應(yīng)性水凝膠

溫度與pH由于其生理意義，是較重要的外部刺激因素，因此溫敏型和pH敏感型的水凝膠被研究得較多，但是近年來(lái)，光敏型水凝膠所受的關(guān)注度越來(lái)越高。與傳統(tǒng)的交聯(lián)誘導(dǎo)方式不同，紫外線照射可以進(jìn)行原位聚合，用于制造具有明確網(wǎng)絡(luò)和彈性的水凝膠材料，能夠達(dá)到時(shí)間以及空間上的精準(zhǔn)控制［9-10］。Haines［11］團(tuán)隊(duì)研究的改性多肽就是用這種方法所合成的，該多肽在正常情況下二級(jí)結(jié)構(gòu)呈線性，受到一定程度的紫外線照射時(shí)發(fā)生自組裝最終形成具有內(nèi)部β-發(fā)夾結(jié)構(gòu)的水凝膠。

1.4 氧化還原響應(yīng)性水凝膠

由氧化還原條件刺激而響應(yīng)的水凝膠是一類較新的環(huán)境響應(yīng)性水凝膠，在受到氧化或是還原條件改變的刺激時(shí)，該類凝膠的氧化還原中心發(fā)生改變，且這種改變通常是可逆的。根據(jù)水凝膠分子氧化還原中心的不同，可將該類環(huán)境響應(yīng)性水凝膠分為二硫類、共軛聚合物類、二茂鐵類、過(guò)渡金屬類以及四硫富瓦烯類。由于生物體中的微環(huán)境也具有一定的氧化還原特性，所以該類水凝膠在生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有較大的應(yīng)用前景［12］。Gao等［13］研制出一種基于透明質(zhì)酸（HA）的還原敏感性水凝膠，該凝膠以氨基乙基二硫化物（AED）作為交聯(lián)劑，對(duì)傷口等微環(huán)境中的谷胱甘肽（GSH）濃度變化敏感。GSH可與ADE反應(yīng)導(dǎo)致凝膠網(wǎng)絡(luò)的裂解，水凝膠產(chǎn)生膨脹等清晰可見的變化，因此可用于傷口修復(fù)及組織再生支架等領(lǐng)域。

2 自組裝多肽

多肽作為一種自然界中普遍存在的生物物質(zhì)，在許多領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用，如在農(nóng)業(yè)中可用作殺蟲劑，在醫(yī)學(xué)中可用作抗菌藥物以及作為藥物化學(xué)中的一些激素類成分。自組裝多肽是一類特殊的多肽，其能夠在特定的條件下利用分子間的各種非共價(jià)作用力來(lái)形成納米級(jí)的纖維、囊泡、納米管或納米球等具有高度有序內(nèi)部結(jié)構(gòu)的多肽分子［14］。自組裝多肽因?yàn)槠渚哂械兔庖叻磻?yīng)、低毒性、生物利用度高、易于制備改造以及生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)在近年來(lái)備受生物醫(yī)藥領(lǐng)域的關(guān)注（如圖1所示）［15］。

圖 自組裝多肽在醫(yī)藥領(lǐng)域中應(yīng)用

2.1 抗菌藥物

研究表明，當(dāng)氨基酸數(shù)量少于20的短肽序列中包含陽(yáng)離子殘基時(shí)，該短肽具有一定的抗菌活性，尤其是當(dāng)肽鏈中富含精氨酸時(shí)，多肽的抗菌活性較明顯且這一特性已被廣泛應(yīng)用。例如從果蠅觸角狀體蛋白中提取的一種由16個(gè)氨基酸組成的穿透蛋白就具有較好的抗菌活性。另一種具有抗菌活性的自組裝多肽為HIV-1的轉(zhuǎn)錄反式激活因子（TAT）［16］。TAT多肽是由11個(gè)氨基酸組成的短肽，因?yàn)槠浒被嵝蛄兄邪?個(gè)精氨酸和2個(gè)賴氨酸，所以整個(gè)肽序的堿性非常強(qiáng)。研究表明，當(dāng)TAT中任何一個(gè)堿性氨基酸被替換為中性氨基酸時(shí)，它的抗菌活性都會(huì)減弱，這是由于精氨酸的存在可以與細(xì)胞膜相互作用導(dǎo)致細(xì)胞泄漏從而發(fā)揮抗菌作用。

Dehsorkhi等［17］在研究由6個(gè)連續(xù)的丙氨酸和精氨酸組成的陽(yáng)離子短肽與1，2-二棕櫚酰磷脂酰膽堿（DPPC）的相互作用時(shí)發(fā)現(xiàn)該陽(yáng)離子短肽具有抗菌的功能。具有抗菌特性的A6R多肽能夠在低濃度下自組裝成片狀結(jié)構(gòu)，在濃度升高后，該陽(yáng)離子短肽可以形成納米管結(jié)構(gòu)且在與DPPC脂質(zhì)囊泡共存時(shí)，A6R的β-折疊被破壞，與囊泡表面的雙層DPPC產(chǎn)生相互作用，在不會(huì)破壞囊泡本身的情況下產(chǎn)生抗菌活性。

Daphne等［18］研究出一種基于多肽的抗菌水凝膠，該多肽MARG1含有20個(gè)氨基酸殘基，當(dāng)用水作溶劑時(shí)，由于帶正電荷的側(cè)鏈間的電荷排斥作用（精氨酸與賴氨酸的存在），肽鏈呈舒展溶解狀態(tài)。當(dāng)溶劑中的鹽離子濃度增加時(shí)，鹽離子屏蔽了側(cè)鏈中的電荷，肽鏈發(fā)生折疊，形成β-發(fā)夾，進(jìn)一步自組裝形成水凝膠。由于MARG1凝膠原纖維層一側(cè)帶有豐富的陽(yáng)離子電荷，因此具有顯著的抗菌活性，對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌等的抗菌效果明顯，且具有易注射等優(yōu)點(diǎn)，因此用于殺菌或預(yù)防潛在感染。

2.2 藥物遞送系統(tǒng)

自組裝多肽可以作為活性藥物治療疾病或修復(fù)受損的器官及組織，也可以作為藥物遞送的載體將疏水性藥物遞送到指定部位后自身降解為安全無(wú)毒的代謝物。利用自組裝多肽的疏水基團(tuán)可以將藥物或多肽本身穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)從而提高活性成分的生物利用度，同時(shí)通過(guò)多肽表面的配受體相互作用可以將活性成分靶向至特定部位。Cheetham的團(tuán)隊(duì)［19］將 tau蛋白的衍生肽與抗腫瘤藥物喜樹堿相結(jié)合，這種具有兩親性的復(fù)合物可以通過(guò)疏水相互作用和分子間的氫鍵作用而形成穩(wěn)定的納米結(jié)構(gòu)，有效提高了喜樹堿的溶解性與選擇性，從而發(fā)揮其藥效。

Zhang等［20］將細(xì)胞穿膜肽TAT作為紫杉醇的遞送材料進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)TAT上結(jié)合的辛酸數(shù)量最多時(shí)，該自組裝多肽載體的疏水性最高，能夠有效包封抗癌藥物紫杉醇，使其被遞送至腫瘤細(xì)胞，是一種高效的藥物遞送手段。

2.3 其他應(yīng)用

自組裝多肽在一定條件下可以形成含水量較高的水凝膠，因?yàn)樗z的比表面積較大，為細(xì)胞的增殖與分化創(chuàng)造了較好的環(huán)境，同時(shí)，凝膠內(nèi)部的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可以通過(guò)一些小分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或代謝產(chǎn)物，與正常細(xì)胞所處的微環(huán)境相似。由于以上優(yōu)點(diǎn)，自組裝多肽水凝膠可以應(yīng)用到組織工程中，作為細(xì)胞培養(yǎng)的支架和基質(zhì)材料。自組裝多肽因其具有良好的水溶性以及生物相容性還可以作為無(wú)機(jī)納米材料的模板，在模仿生物礦化的過(guò)程（生物體內(nèi)無(wú)機(jī)礦物的形成過(guò)程，如骨骼、結(jié)石的形成等）中制備出無(wú)機(jī)納米材料如二氧化硅納米材料等。此外，自組裝多肽還可應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)、傷口愈合、穩(wěn)定膜蛋白以及三維組織印刷等領(lǐng)域［15］。

3 凝膠形成機(jī)制

如上所述，水凝膠是由親水聚合物組成，含有大量水分的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的宏觀體現(xiàn)［21］。在多種凝膠體系中，多肽水凝膠因其合成的多樣性、較強(qiáng)的凝膠能力、良好的生物相容性及生物活性是最佳的生物功能材料之一，可應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)、組織工程、藥物遞送、腫瘤治療、再生醫(yī)學(xué)等生物醫(yī)藥領(lǐng)域。

目前，設(shè)計(jì)優(yōu)良的合成肽通常可以形成能夠通過(guò)對(duì)外界刺激的反饋進(jìn)行自組裝結(jié)構(gòu)微調(diào)的功能性水凝膠。自組裝多肽水凝膠的形成是一個(gè)分段的過(guò)程［22］：溶液中的多肽分子首先形成特殊的二級(jí)結(jié)構(gòu)如α-螺旋、β-折疊、β-發(fā)夾或卷曲螺旋（見圖2），再經(jīng)過(guò)一定程度的外部刺激或是適當(dāng)?shù)奈锢項(xiàng)l件處理后，自組裝形成納米纖維，隨著時(shí)間或濃度的增加，三維空間中的納米纖維逐漸變厚、變長(zhǎng)，從而形成纖維網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)，水分子被包裹在多肽的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，宏觀上就形成了具有一定機(jī)械強(qiáng)度的水凝膠。設(shè)計(jì)出性質(zhì)優(yōu)良的環(huán)境響應(yīng)性多肽水凝膠體系首先需要深入了解形成水凝膠的機(jī)制以及自組裝多肽分子內(nèi)部的相互作用，其主要的4種分子作用機(jī)制分別是疏水作用、π-π堆積、氫鍵作用以及靜電作用。

3.1 疏水相互作用

多肽可以通過(guò)多種非共價(jià)相互作用形成水凝膠或其他有序的超分子結(jié)構(gòu)。研究表明當(dāng)多肽中的氨基酸與較大的芳香基團(tuán)結(jié)合后更易形成水凝膠。我們可以通過(guò)在相同的多肽或氨基酸上連接不同的化學(xué)偶聯(lián)物來(lái)比較芳香基團(tuán)在多肽形成水凝膠（尤其是低分子水凝膠）的作用，如有報(bào)道稱用9-芴甲氧羰基保護(hù)的酪氨酸（Fmoc-Tyr）可以輕易發(fā)生自組裝從而形成水凝膠，但將Fmoc保護(hù)基換成非芳香族的叔丁氧羰基（Boc）或芳香性較弱的芐醇保護(hù)基（Cbz）時(shí)，水凝膠將無(wú)法形成。Subhasish等［23］利用芳香族間的相互作用設(shè)計(jì)出一種苯丙氨酸衍生物，它是一種由苯丙氨酸與芳香基團(tuán)（芴基、萘基、萘氧基或肉桂基）結(jié)合而成的一種高效的凝膠劑，研究表明即使是芳香性最小的肉桂基也提供了足夠的疏水作用使苯丙氨酸形成水凝膠劑。此外，Ou團(tuán)隊(duì)［24］還研究了四肽（Gly-Pheo-Phep-Tyr）在不同芳香基團(tuán)的修飾下形成水凝膠的情況。研究表明，與Nap（2-萘乙酸）或PTZ（吩噻嗪）基團(tuán)相比，用Cbz-修飾的多肽的成膠性能較弱，Cbz-Gly-Phep-Tyr能夠形成凝膠的最低質(zhì)量濃度為5%，用Fmoc-和Nap-修飾的多肽的最低成膠濃度為0.08 wt.%,而用PTZ修飾的四肽在質(zhì)量濃度為0.01%的情況下即可形成穩(wěn)定的水凝膠。

圖2 自組裝多肽形成不同二級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖：(a)β-折疊，(b)β-發(fā)夾，(c)α-螺旋，(d)卷曲螺旋

3.2 π-π相互作用

有報(bào)道稱，與Gly-Ala-Ile-Leu相比，Gly-Phe-Ile-Leu具有更好的成膠性能，為了研究芳香族殘基在多肽形成水凝膠自組裝過(guò)程中的作用，Xu等［25］著重研究了Fmoc-Tyr形成凝膠的機(jī)制，研究發(fā)現(xiàn)多肽形成水凝膠存在4種可能的驅(qū)動(dòng)模式，其中一種就是Fmoc-基團(tuán)與酪氨酸的苯基發(fā)生π-π堆積作用。此外，一些對(duì)Fmoc-Phe-Phe超分子結(jié)構(gòu)以及Fmoc-Ala-Ala自組裝的研究中發(fā)現(xiàn)π-π堆積在多肽形成水凝膠的自組裝過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，用Fmoc-DAla-DAla水凝膠進(jìn)行的分子動(dòng)力學(xué)模擬實(shí)驗(yàn)也表明了π-π堆積是水凝膠形成的一個(gè)重要驅(qū)動(dòng)力。

3.3 氫鍵作用

α-螺旋是蛋白質(zhì)和多肽類結(jié)構(gòu)中的一個(gè)重要二級(jí)結(jié)構(gòu)類型，通常是由多肽主鏈纏繞成右手螺旋形成，每圈含有3.6個(gè)氨基酸，也是一部分多肽水凝膠內(nèi)部存在的主要結(jié)構(gòu)之一。在α-螺旋中，主鏈內(nèi)部的穩(wěn)定主要由第i位的羰基氧和第i+4位的N-H-形成的氫鍵來(lái)穩(wěn)定。與β-折疊的結(jié)構(gòu)不同，α-螺旋中的氫鍵屬于分子內(nèi)的相互作用，所以結(jié)構(gòu)單元不是連續(xù)的［26］。多肽α-螺旋中的氫鍵作用力與疏水作用、范德瓦爾斯力一起對(duì)整體結(jié)構(gòu)起到穩(wěn)定作用，使得所形成的水凝膠更加穩(wěn)定。

3.4 靜電作用

除了以上所述的幾種作用力，另一種促使多肽形成凝膠的作用力是多肽帶相反電荷分子之間的靜電作用。Xu等［27］研究了3種多肽（Val-Arg-Gly-Asp-Val，Gly-Arg-Gly-Asp-Gly，Lys-Lys-Arg-Gly-Asp-Lys）的成膠情況發(fā)現(xiàn)，當(dāng)把這3種多肽的任意兩種水凝膠在pH為中性的水溶液中混合時(shí)，由于靜電作用促進(jìn)自組裝的形成從而形成超分子水凝膠。與其他作用力誘導(dǎo)的成膠相比，以靜電作用為主要驅(qū)動(dòng)力的多肽水凝膠即使其內(nèi)部結(jié)構(gòu)較大時(shí)也較易形成［28］。

4 結(jié)語(yǔ)

雖然環(huán)境響應(yīng)性自組裝多肽水凝膠與其他生物功能材料相比具有可降解性、生物相容性及合成的多樣性等優(yōu)點(diǎn)，但是也存在一些局限，如與其他聚合物水凝膠相比，多肽水凝膠的機(jī)械強(qiáng)度較低，需要提高水凝膠在體內(nèi)的穩(wěn)定性；多肽合成的成本較高，尤其是含有特殊氨基酸和特殊結(jié)構(gòu)的多肽分子合成難度較高，不太適合批量化生產(chǎn)。在今后的發(fā)展中，研究可以通過(guò)改變多肽的結(jié)構(gòu)從而改善多肽水凝膠的性質(zhì)，并與其他功能材料相結(jié)合，取長(zhǎng)補(bǔ)短，使其具有更加廣泛的應(yīng)用。