腦缺血急性期神經血管單元的變化及三七干預作用研究

梁萍 黃清 農立宇 林軍 蒙蘭青

缺血性腦卒中是臨床常見病，約占全球死亡總數的11%，且由于人們生活習慣、飲食、作息時間的不規律，缺血性腦卒中愈益年輕化，嚴重威脅人們的身體健康[1]。隨著醫學水平的不斷提高，人們發現具有多重藥理作用的三七在治療腦缺血再灌注損傷（ischemic/reperfusion，I/R）中發揮重要作用。三七是五加科人參屬草本植物，含有人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1和三七皂苷R1 等活性成分，可通過抑制細胞內鈣超載、清除自由基、抗炎、保護血腦屏障及抑制細胞凋亡等作用于缺血性腦卒中病理過程多個環節，協同促進腦缺血后神經血管單元（neurovascular unit，NVU）的修復，從而減輕腦缺血損傷[2]。但目前尚無三七整體活性物質用于腦I/R損傷的治療方法。本研究中，我們通過制作腦I/R損傷大鼠模型，觀察大鼠神經行為學表現、腦梗死體積百分比、NVU 超微結構變化，探討腦I/R 后NVU 的變化及三七干預對大鼠的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級SD雄性大鼠70只，體重（250± 30）g，購自湖南省長沙市天勤生物技術有限公司，許可證號為SCXK（湘）2014-0011。實驗過程嚴格執行《中國實驗動物使用和管理辦法》。

1.2 藥品與主要試劑三七粉（批號：160922，文山市苗鄉三七實業有限公司）；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（批號：20180604，北京索萊寶生物科技有限公司）；水合氯醛（批號：2015031101，成都市科龍化工試劑廠）；多聚甲醛（批號：20180730，北京索萊寶生物科技有限公司）；無水乙醇、丙酮（國藥集團化學試劑有限公司）；812 包埋劑（批號：90529-77-4，SPI公司）。

1.3 儀器Leica UC7型超薄切片機（Leica公司）；Ultra 45°型鉆石切片刀（Daitome公司）；HT7700型透射電子顯微鏡（HITACHI公司）。

1.4 方法

1.4.1 分組 SPF級SD 雄性大鼠隨機分為假手術組、對照組、三七組。假手術組、對照組均分為干預前、干預后亞組；三七組又分為低（50mg/kg）、中（100mg/kg）和高劑量組（150mg/kg）。每個小組大鼠10只。

1.4.2 腦缺血損傷模型的制備 對照組和三七組大鼠參考Zea Longa 制作大鼠局灶性大腦中動脈缺血模型[3]：SD 雄性大鼠在造模前喂養10d，術前12h禁飼料、4h 禁水，10%水合氯醛（0.0035ml/g）腹腔麻醉大鼠，備皮消毒，頸部正中作一切口，逐層分離皮下筋膜、肌肉、右側頸總動脈、頸外動脈及頸內動脈；結扎右側頸總動脈近心端、頸外動脈近心端，夾閉右側頸總動脈遠心端；在右側頸總動脈結扎與夾閉之間剪開一小口，并將一根直徑0.235mm、長4.8cm、頭部圓鈍的線栓緩慢送入右側頸內動脈，深度為18～19mm；縫合線系緊線栓，消毒、縫合切口。缺血2h 后緩慢拔出線栓約1cm，剪去皮外多余線栓，完成腦缺血再灌注損傷制備。假手術組線栓插入頸內動脈深度為8～10mm，未造成腦缺血。各組大鼠Zea Longa 5級神經功能行為學評分為0分或者4 分者均用同批次大鼠及時補足10只。

1.4.3 干預措施 三七組3個亞組大鼠在腦缺血再灌注2h 后分別按大鼠體重取用三七粉（50mg/kg、100mg/kg、150mg/kg），并用生理鹽水稀釋配成終濃度為5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml 的溶液灌胃，之后每天2次；對照組干預后亞組、假手術組干預后亞組大鼠在相同的時間點給予等量生理鹽水灌胃。其余大鼠不做處理。術后干預7d。

1.4.4 神經功能行為學評分 再灌注7d 時根據Zea Longa評分標準對大鼠進行神經功能行為學評分。

1.4.5 TTC染色測定大鼠腦梗死體積百分比 7d 后對大鼠進行腹腔麻醉、斷頭取腦，快速清除表面血跡，去除嗅球、小腦、低位腦干；先后經過冷凍、冠狀位切片、染色等步驟后予生理鹽水終止染色，4%多聚甲醛固定；24h 后拍照；采用Image-Pro Plus 6.0圖片分析軟件計算腦梗死體積百分比。

1.4.6 透射電鏡觀察腦細胞超微結構的變化 干預7d 后，進行腹腔麻醉、心臟放血、斷頭取腦，將裁剪腦組織置入電鏡液固定，1%鋨酸·0.1M 磷酸緩沖液固定，先后經過酒精、丙酮脫水，丙酮、812 包埋劑滲透，包埋，切片，染色后在透射電鏡下觀察、分析。

1.5 統計學分析采用SPSS 13.0 軟件進行統計學分析，計量資料采用±s表示，各組數據在滿足正態分布和方差齊性時，組間采用單因素方差分析，組間兩兩比較用SNK-q 檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠I/R損傷模型的建立三七組、對照組大鼠造模成功表現為病灶對側前肢不能完全伸直，或行走時向病灶對側轉圈或傾倒。

2.2 各組大鼠再灌注后Zea Longa 神經功能行為學評分比較干預7d 后評分顯示，假手術組干預前后神經功能缺損評分均為0；對照組干預前后神經功能評分比較差異無統計學意義（P＞0.05）；三七組大鼠神經功能缺損評分逐漸改善，明顯低于同一時間點對照組，差異均有統計學意義（P＜0.01）；三七中、高劑量組與低劑量組相比，差異均有統計學意義（P＜0.01），但中、高劑量組之間差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠再灌注后神經功能行為學評分比較（±s，n=10）

表1 各組大鼠再灌注后神經功能行為學評分比較（±s，n=10）

注：與同時間點對照組干預后比較，▲P＜0.01；與同時間點50mg/kg劑量組比較，#P＜0.01

時間 假手術組 對照組 三七組干預前 干預后 干預前 干預后 50mg/kg 100mg/kg 150mg/kg再灌注2h 0 0 2.10±0.32 1.90±0.58 1.89±0.60 1.90±0.58 1.60±0.52干預7d 0 0 1.30±0.26 1.25±0.26 0.90±0.21▲ 0.65±0.24▲# 0.50±0.00▲#

2.3 各組大鼠腦梗死體積變化比較假手術組干預前后均未見梗死灶，其他各組均有不同程度的梗死灶形成。對照組干預前平均腦梗死體積百分比為41.68%，干預后平均腦梗死體積百分比為39.72%，與假手術組相比差異有統計學意義（P＜0.01），但組內比較差異無統計學意義（P＞0.05）；三七低、中、高劑量組平均腦梗死體積百分比分別為25.67%、15.07%、8.36%，與對照組干預后相比，腦梗死體積百分比降低，且呈劑量依賴關系，差異有統計學意義（P＜0.01）。

2.4 各組大鼠NVU超微結構變化比較

2.4.1 各組大鼠神經元電鏡下形態學變化 假手術組神經元細胞核核膜清晰，染色質分布均勻，電子密度低，線粒體有輕微擴張，線粒體嵴尚清晰，粗面內質網輕微擴張。對照組干預前亞組神經元周圍水腫嚴重、成片狀空白溶解區；細胞膜破裂，細胞器流失；細胞核皺縮，染色質分布尚均勻；線粒體中度腫脹，結構模糊，大部分細胞器溶解破壞。對照組干預后亞組細胞核尚完整、核膜尚清晰，但核內常染色質減少，異染色質增多，大部分線粒體嵴斷裂消失，呈空泡樣改變，胞質內溶酶體數量明顯增多，內質網輕微擴張，結構模糊，高爾基體數目減少。三七低劑量組神經元細胞核核膜較為清晰，染色質分布均勻；線粒體有明顯腫脹擴張，部分嵴消失、斷裂，呈空泡化改變；粗面內質網輕微擴張（同高爾基體），部分結構破壞，有核糖體脫失。三七中劑量組核膜較為清晰，細胞核分裂，團塊狀核仁邊集，線粒體、粗面內質網輕微擴張，細胞狀態較低劑量組好。三七高劑量組細胞核核膜清晰，細胞核分裂，染色質分布均勻，電子密度低，線粒體、粗面內質網結構輕微擴張。見圖1。

圖1 各組大鼠神經元電鏡下超微結構圖（×2500）

2.4.2 各組大鼠星形膠質細胞電鏡下形態學變化 假手術組星形膠質細胞胞核大，橢圓形，核膜清晰完整，細胞核稍皺縮，染色質輕微碎裂，邊集；細胞膜結構完整；胞質內細胞器豐富，線粒體輕微擴張，嵴清晰可見，粗面內質網結構輕微疏松擴張。對照組干預前亞組星形膠質細胞明顯呈水腫、空泡化改變，細胞核呈異形改變，核內空洞形成，線粒體明顯腫脹、空泡化，高爾基體重度腫脹擴張（板層結構消失），粗面內質網擴張，出現大量內質網空泡。對照組干預后亞組星形膠質細胞整體狀態不佳，水腫現象嚴重；核皺縮明顯，核膜結構不清晰，核染色質輕微碎裂、邊集；細胞膜斷裂，細胞器流失，線粒體重度腫脹擴張，嵴消失，呈空泡化改變，內質網輕微擴張，高爾基體明顯腫脹，結構紊亂。三七低劑量組星形膠質細胞周圍水腫，細胞核輕度皺縮，線粒體重度擴張（損傷程度大于中、高劑量組），大部分線粒體嵴斷裂消失并呈空泡化改變，高爾基體重度擴張（板層結構消失），粗面內質網擴張并出現內質網空泡（與中、高劑量組相似），見1個自噬溶酶體。三七中劑量組星形膠質細胞周圍明顯呈水腫、空泡化改變；細胞外形不規則，胞核皺縮，細胞核呈異形改變；線粒體有中度腫脹擴張，嵴消失，呈空泡化改變，高爾基體腫脹擴張（板層結構尚存），粗面內質網擴張，出現大量內質網空泡，水腫損傷程度輕于低劑量組。三七高劑量組星形膠質細胞周圍輕度水腫、空泡化改變，細胞核呈異形改變，線粒體有中度腫脹擴張，嵴消失，部分呈空泡化改變，高爾基體中度腫脹擴張，粗面內質網擴張，出現中等量內質網空泡。見圖2。

2.4.3 各組大鼠腦微血管內皮細胞電鏡下形態學變化 假手術組微血管內皮細胞周圍無水腫，致密間隙無擴大，基底膜連續，管腔基本正常，細胞核無明顯皺縮，線粒體輕微腫脹。對照組干預前亞組微血管內皮細胞周圍水腫嚴重，可見空泡狀或空白區，緊密連接破壞，通透性增加，管腔尚可。對照組干預后亞組微血管內皮細胞變形明顯，周圍結構溶解、水腫嚴重，核固縮，管腔重度狹窄，線粒體輕度腫脹，結構模糊。三七低劑量組微血管內皮細胞周圍無明顯水腫現象，基底膜尚連續，胞核不規則改變，管腔中度狹窄，線粒體結構模糊。三七中劑量組細胞外形較低劑量組規則，周圍無水腫，致密間隙無擴大，基底膜連續、薄厚均勻，胞核固縮，管腔輕度狹窄，線粒體結構模糊。三七高劑量組微血管內皮細胞周圍輕度水腫，但細胞變形不明顯，管腔基本通暢，線粒體結構正常，嵴清晰。見圖3。

圖2 各組大鼠星形膠質細胞電鏡下超微結構圖（×2500）

圖3 各組大鼠腦微血管內皮細胞電鏡下超微結構圖（×2500）

3 討論

神經元是中樞系統信息接收、傳遞的關鍵[4]；星形膠質細胞釋放的神經營養因子是神經元存活、血管再生介質的基礎，是腦缺血損傷后神經保護和神經調節的極好備用資源[5]；血管系統為腦細胞輸送氧氣和營養物質，共同形成的血腦屏障是NVU 發揮作用的一個重要結構。腦缺血再灌注損傷后腦微血管內皮細胞受損，進一步導致的血管痙攣加劇腦缺血所致的缺血缺氧損傷。腦缺血后的逐層放大效應可逐漸累及毛細血管周邊的星形膠質細胞，繼而凋亡的星形膠質細胞會產生細胞毒性殺死鄰近的神經元。腦I/R損傷是缺血性腦卒中重要的發生過程，興奮性毒性損傷、氧化應激、細胞凋亡等過程貫穿了缺血性腦卒中病理過程各個環節，最終導致不可逆的腦細胞凋亡[6]。凋亡過程涉及神經元、星形膠質細胞、微血管內皮細胞及基質成分；神經血管單元作為腦I/R損傷的整體治療模型強調了整體保護的重要性[7]。

研究證實，三七治療腦缺血損傷療效顯著。人參皂苷Rg1、Rb1、三七皂苷R1 配伍具有協同抗腦缺血損傷作用，顯著對抗腦I/R 急性期的能量代謝障礙[8]。三七皂苷R1 通過抑制鈣離子內質網流出通道—IP3 活化，以對抗因鈣離子過度釋放引起的腦血栓形成[9]。三七多糖可能通過抑制腦缺血后脂質過氧化反應和炎癥反應有效緩解腦缺血損傷[10]。腦缺血損傷發生后，三七成分之一的人參皂苷加速神經干細胞的增殖，并向神經元、星形膠質細胞分化[11]。三七三醇皂苷能夠促進血管再生和側枝循環的建立，增加缺血區周邊腦血液供應，減小腦梗死體積[12]。人參皂苷Rg1 通過抑制Caspase-3 的表達明顯減少細胞凋亡等[13]。三七以其多途徑、多靶點的藥理作用特點促進NVU 的修復，對于腦缺血再灌注損傷治療過程至關重要。

我們利用線栓法制作腦缺血損傷大鼠模型，缺血2h、再灌注7d，從大鼠神經功能缺損評分、腦梗死體積百分比、細胞超微結構方面研究三七的治療效果。結果顯示，三七可通過減小大鼠腦梗死體積及減輕NVU 超微結構損傷，改善大鼠神經功能行為。然而，目前關于三七對腦I/R損傷的神經保護作用只是初步的認識，其具體機制尚有待進一步探討。本課題組既往已證實三七可通過增加NVU 組分神經元、膠質細胞和血管內皮細胞神經元核抗原蛋白、膠質纖維酸性蛋白、層黏連蛋白表達，多靶點促進神經血管單元修復，明顯改善神經血管單元的超微結構[14]，今后將繼續深入研究三七如何多途徑作用于腦I/R損傷。