Ki-67、CK5/6、P53、P63的表達(dá)與食管鱗癌發(fā)生發(fā)展及臨床病理特征的相關(guān)性

高攀，楊琛擘，余偉，趙鵬程，趙莉莉，王富強(qiáng)，申培紅

(1.鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 a.臨床病理中心;b.外科，河南 鄭州 450008；2.河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，河南 開(kāi)封 475000；3.安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院 病理中心，河南 安陽(yáng) 455000)

我國(guó)食管癌發(fā)病雖有明顯的地區(qū)差異，但食管癌病死率均較高。近年來(lái)食管癌發(fā)病率有所下降，但死亡率一直位居第4位[1]。據(jù)最新流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示我國(guó)食管癌發(fā)病率和死亡率均高于西方國(guó)家[2]。食管腺癌在北美和歐洲的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，但食管鱗狀細(xì)胞癌仍是世界范圍內(nèi)食管癌的主要組織學(xué)類(lèi)型[3]。食管鱗癌是一種惡性腫瘤，發(fā)病率高，預(yù)后差。因此，尋找能夠篩選提示鱗癌的分子標(biāo)志物對(duì)食管鱗癌的防治具有重要意義。細(xì)胞角蛋白5/6(cytokeratin5/6，CK5/6)已被證實(shí)為三陰性乳腺癌的特征性分子標(biāo)記物，在基底層細(xì)胞中特異性表達(dá)。Ki-67是一種在靜止期細(xì)胞中不表達(dá)的非組蛋白，只能在細(xì)胞增殖期被檢測(cè)到，反映細(xì)胞的增殖活性。P53是一種抑癌基因，50%以上腫瘤的發(fā)生發(fā)展都伴有P53的突變或異常表達(dá)。P63與P53基因具有高度同源性，主要存在于移行上皮與鱗狀上皮的基底細(xì)胞中。CK5/6、Ki-67、P53、P63之間的關(guān)系如何，目前國(guó)內(nèi)的研究相對(duì)較少。本研究通過(guò)探討CK5/6、Ki-67、P53、P63在食管鱗癌患者中的表達(dá)及彼此間的相關(guān)性，分析其與食管鱗癌患者臨床病理特征間的關(guān)系，為其在提示食管鱗癌預(yù)后和風(fēng)險(xiǎn)分級(jí)中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)以及為食管鱗癌新一代靶向藥物的研發(fā)提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料回顧性分析2017年1月至2019年4月安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院及鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理中心確診的3 200例食管癌患者的病歷資料。根據(jù)食管癌診療標(biāo)準(zhǔn)(2019版)，組織學(xué)分型使用2010版消化系統(tǒng)腫瘤WHO分類(lèi)，經(jīng)病理活檢診斷為食管鱗癌、食管非鱗癌(腺癌、癌肉瘤、印戒細(xì)胞癌、神經(jīng)內(nèi)分泌癌、上皮內(nèi)瘤變等)。剔除合并其他腫瘤和缺失病歷或病理資料的446例患者，2 754例患者中篩選出均未接受Ki-67、CK5/6、P53、P63病理檢測(cè)的2 215例患者，最終539例患者納入研究。根據(jù)2018年常見(jiàn)腫瘤AJCC食管癌/食管與胃食管交界處腫瘤分期(第八版)統(tǒng)計(jì)食管癌患者病理的浸潤(rùn)深度、區(qū)域淋巴結(jié)以及是否有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況，進(jìn)行TNM分期，將其分為0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期。組織學(xué)分級(jí)：鱗狀細(xì)胞癌和腺癌依據(jù)分化程度分為高分化(G1)、中分化(G2)、低分化(G3)以及分級(jí)情況不確定和無(wú)法評(píng)估(Gx)。食管鱗癌(271例)：男188例，女83例；年齡43～87歲，平均(64.85±7.53)歲；TNM分期為0期2例，Ⅰ期47例，Ⅱ期98例，Ⅲ期107例，Ⅳ期17例；組織學(xué)分級(jí)為Gx期18例，G1期27例，G2期109例，G3期117例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況為N0(無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)139例，N1(1～2個(gè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)63例，N2(3～6個(gè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)54例，N3(≥7個(gè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)15例。食管非鱗癌(268例)：男205例，女63例；年齡29～91歲，平均(66.03±7.84)歲；TNM分期為0期0例，Ⅰ期24例，Ⅱ期86例，Ⅲ期122例，Ⅳ期36例；組織學(xué)分級(jí)為Gx期69例，G1期5例，G2期82例，G3期112例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況為N0104例，N160例，N268例，N336例。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)被安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院及鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理中心確診為食管癌(鱗癌和非鱗癌)；(2)取患者部分食管、部分胃及區(qū)域淋巴結(jié)進(jìn)行活檢；(3)不伴有其他重要器官嚴(yán)重病變，如心、肺功能不全；(4)患者有完整的病理及臨床資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)未經(jīng)病理中心檢查的病例；(2)病理、臨床資料不完善及缺少本研究所需指標(biāo)的患者。

1.3 檢測(cè)方法免疫組化染色：將所有標(biāo)本制成常規(guī)組織石蠟切片后，采用streptavidin- peroxidase(SP)免疫組織化學(xué)法進(jìn)行染色。抗體購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。結(jié)果判定如下。CK5/6陽(yáng)性細(xì)胞為在細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色或黃色顆粒的腫瘤細(xì)胞；標(biāo)本中隨機(jī)選取10個(gè)高倍鏡視野(×400)，平均陽(yáng)性細(xì)胞率≥5%記為(+)，<5%記為(-)。Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞為細(xì)胞核呈棕黃色或黃色顆粒的細(xì)胞，取任意10個(gè)高倍視野(×400)，平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤10%為陰性(-)，>10%為陽(yáng)性(+)。P53、P63以細(xì)胞核出現(xiàn)黃褐色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，P53、P63以陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤10%為陰性(-)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>10%為陽(yáng)性(+)。由病理中心兩名高級(jí)別職稱(chēng)的醫(yī)生采用獨(dú)立雙盲觀察免疫組織化學(xué)染色切片，判斷細(xì)胞的染色強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1 食管鱗癌和食管非鱗癌患者臨床指標(biāo)539例腫瘤標(biāo)本中，實(shí)際獲得455例Ki-67檢測(cè)結(jié)果，其中Ki-67陽(yáng)性表達(dá)427例，占93.8%，陰性表達(dá)28例，占6.2%。143例CK5/6檢測(cè)結(jié)果，其中陽(yáng)性表達(dá)112例，占78.3%，陰性表達(dá)31例，占21.7%。359例P53檢測(cè)結(jié)果，其中陽(yáng)性表達(dá)261例，占72.7%，陰性表達(dá)98例，占27.3%。308例P63檢測(cè)結(jié)果，其中陽(yáng)性表達(dá)259例，占84.1%，陰性表達(dá)49例，占15.9%。食管鱗癌和食管非鱗癌患者神經(jīng)侵犯、脈管癌栓、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、組織學(xué)分級(jí)、CK5/6、Ki-67、P63比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 食管鱗癌和食管非鱗癌患者臨床指標(biāo)比較[n(%)]

2.2 Ki-67、CK5/6、P53、P63表達(dá)與食管鱗癌患者臨床指標(biāo)的關(guān)系食管鱗癌中231例Ki-67檢測(cè)結(jié)果中陽(yáng)性表達(dá)207例，占89.6%，陰性表達(dá)24例，占10.4%。98例CK5/6檢測(cè)中陽(yáng)性表達(dá)93例，占94.9%，陰性表達(dá)5例，占5.1%。144例P53檢測(cè)中陽(yáng)性表達(dá)98例，占68.1%，陰性表達(dá)46例，占31.9%。244例P63檢測(cè)中陽(yáng)性表達(dá)235例，占96.3%，陰性表達(dá)9例，占3.7%。在食管鱗癌中，P53與TNM分期有關(guān)(P<0.05)，與年齡、性別、脈管癌栓、神經(jīng)侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級(jí)均無(wú)關(guān)(均P>0.05)；Ki-67、CK5/6、P63與年齡、性別、脈管癌栓、神經(jīng)侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、組織學(xué)分級(jí)均無(wú)關(guān)(均P>0.05)。見(jiàn)表2。

2.3 食管鱗癌中CK5/6、Ki-67、P53、P63的相關(guān)性Spearman相關(guān)性分析顯示，在食管鱗癌中，CK5/6與Ki-67、P53與P63、CK5/6與P53、CK5/6與P63、Ki67與P53、Ki-67與P63在食管鱗癌中的表達(dá)均呈正相關(guān)(r1=0.920、r2=0.741、r3=0.645、r4=0.967、r5=0.724、r6=0.939，均P<0.05)。

3 討論

食管癌屬于消化道系統(tǒng)的惡性腫瘤，根據(jù)組織學(xué)類(lèi)型分為鱗癌、腺癌、小細(xì)胞未分化癌和癌肉瘤等，其中鱗癌最為常見(jiàn)[3]。食管鱗癌分子標(biāo)記物較多，缺乏特異性，各腫瘤分子標(biāo)記物之間的相關(guān)性研究較少。本研究以CK5/6、Ki-67、P53、P63 4種腫瘤分子標(biāo)記物為中心，探討4種腫瘤標(biāo)記物與食管鱗癌各臨床指標(biāo)以及自身之間的相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)，CK5/6、P63是鱗癌中常用的標(biāo)記物，在原發(fā)性肺鱗癌中CK5/6的敏感性略高于P63，特異性與P63相似，在轉(zhuǎn)移性肺鱗癌中CK5/6和P63的敏感性相同，但CK5/6的特異性高于P63[4]。Shibata等[5]研究發(fā)現(xiàn)，P53、Ki-67與食管鱗癌淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移相關(guān)。不同的病理類(lèi)型，治療方案不同。本研究中納入CK5/6、Ki-67、P53、P63 4個(gè)研究指標(biāo)，結(jié)果顯示，與食管非鱗癌相比，食管鱗癌中CK5/6、Ki-67、P63表達(dá)水平較高，表明食管鱗癌預(yù)后差，死亡率高及這3項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)可用于區(qū)分食管鱗癌與非食管鱗癌，用于指導(dǎo)臨床用藥。P53與TNM分期相關(guān)，說(shuō)明Ⅲ～Ⅳ期P53陽(yáng)性率高于0～Ⅱ期，即P53可用于預(yù)后評(píng)判，其與食管癌的發(fā)生發(fā)展存在一定聯(lián)系，還需大量臨床研究進(jìn)一步證實(shí)。

食管鱗癌是食管癌組織學(xué)分型的一種，屬于預(yù)后不良的惡性腫瘤之一，5年生存率不足30%[6]。CK5/6主要表達(dá)在皮膚的基底細(xì)胞、棘層細(xì)胞和部分前列腺基底細(xì)胞，于其他單層腺上皮不表達(dá)，常用于三陰性乳腺癌的研究，較少用于食管鱗癌的研究。有研究表明，CK5/6的表達(dá)可以作為乳腺癌的預(yù)后標(biāo)志物[7]，CK5/6陽(yáng)性為乳腺癌預(yù)后差的標(biāo)志[8]。目前研究對(duì)于CK5/6與年齡、腫瘤大小、組織學(xué)分級(jí)、臨床分期的相關(guān)性仍存在爭(zhēng)議[9]。本研究中CK5/6與患者年齡、性別、脈管癌栓、神經(jīng)侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、組織學(xué)分級(jí)均無(wú)關(guān)，在食管鱗癌中也證實(shí)了這一點(diǎn)，還需進(jìn)一步增加樣本量來(lái)提高可靠性。

表2 Ki-67、CK5/6、P53、P63表達(dá)與食管鱗癌患者臨床指標(biāo)的關(guān)系

注：回顧性研究存在部分檢測(cè)數(shù)據(jù)缺失。

Ki-67是一種能有效反映細(xì)胞增殖的標(biāo)志物，位于細(xì)胞核內(nèi)，在細(xì)胞增殖的過(guò)程中表達(dá)，有絲分裂期達(dá)到峰值，靜止期的細(xì)胞不表達(dá)。據(jù)研究報(bào)道，Ki-67可以作為評(píng)價(jià)化療敏感性的標(biāo)志物[10-12]。研究發(fā)現(xiàn)，Ki-67與臨床病理特征及患者預(yù)后具有顯著的相關(guān)性[13-15]。在本研究中食管鱗癌患者雖然高表達(dá)Ki-67，但Ki-67與臨床病理特征無(wú)相關(guān)性。目前Ki-67的臨界值無(wú)法統(tǒng)一，為1%～35%，僅St.Gallen共識(shí)就進(jìn)行了4次調(diào)整[16-19]，這可能是導(dǎo)致研究結(jié)果不一致的原因之一。本研究數(shù)據(jù)較少，且食管癌存在明顯地區(qū)差異，故仍需要大量研究進(jìn)一步證實(shí)。

P53基因是一種抑癌基因，它與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有明顯的相關(guān)性。研究表明，在所有惡性腫瘤中，該基因的突變率約為50%[20]。Huang等[21]研究發(fā)現(xiàn)，P53基因突變后，腫瘤的侵襲力增強(qiáng)，這可能表明P53與分期存在相關(guān)性。由于P53改變是食管鱗癌治療反應(yīng)和生存的良好預(yù)測(cè)因子，P53正常的患者5年生存率高于P53突變患者[22]。本研究中P53的表達(dá)與臨床TNM分期有關(guān)，即Ⅲ～Ⅳ期的食管癌患者P53的陽(yáng)性表達(dá)高于0～Ⅱ期的患者，進(jìn)一步表明P53與腫瘤預(yù)后相關(guān)。目前，以P53為靶點(diǎn)的研究已成為治療癌癥的焦點(diǎn)。有研究表明，化學(xué)物質(zhì)與P53靶標(biāo)組合為治療藥物可以增強(qiáng)對(duì)P53突變腫瘤的功效，并減少對(duì)正常細(xì)胞和組織的毒副作用[23]。本研究中，P53在食管鱗癌與食管非鱗癌患者中表達(dá)無(wú)顯著差異，表明P53無(wú)論在食管鱗癌還是食管非鱗癌中均呈高表達(dá)，不可用于食管癌的鑒別診斷，但為靶向藥物的研發(fā)提供依據(jù)。

P63表達(dá)于上皮組織基底層，在正常上皮組織的形成中發(fā)揮重要作用，P63在鱗狀細(xì)胞源性的各種良惡性腫瘤組織中均表達(dá)，尤其在鱗狀細(xì)胞癌組織中表達(dá)增強(qiáng)，且表達(dá)頻率及分布與鱗癌細(xì)胞間變程度顯著相關(guān)[24]。本研究中P63在食管鱗癌與食管非鱗癌患者中表達(dá)存在顯著差異，可與CK5/6、Ki-67聯(lián)合檢測(cè)用于食管鱗癌的診斷。

周晨陽(yáng)等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在三陰性乳腺癌腫瘤組織中CK5/6、Ki-67呈正相關(guān)，CK5/6與P53、P63無(wú)相關(guān)性，Ki-67與P53、P63無(wú)相關(guān)性，與本研究結(jié)果不相符。這可能與本研究為回顧性分析，所選資料存在選擇性偏倚或不同腫瘤中其腫瘤分子標(biāo)志物表達(dá)不同有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，CK5/6、Ki-67、P53、P63在食管鱗癌中的表達(dá)均呈正相關(guān)，反映了CK5/6、Ki-67、P53、P63在食管鱗癌中表達(dá)的一致性，利于食管鱗癌預(yù)后的評(píng)估及風(fēng)險(xiǎn)分級(jí)，或許聯(lián)合應(yīng)用能夠增強(qiáng)檢測(cè)食管鱗癌的敏感性及特異性。

由于食管非鱗癌較為少見(jiàn)，尚未在食管非鱗癌中對(duì)CK5/6、Ki-67、P53、P63進(jìn)行相關(guān)分析，這也是需要進(jìn)一步探討的問(wèn)題，希望能對(duì)食管鱗癌的鑒別診斷和危險(xiǎn)分級(jí)提供參考，對(duì)研究食管靶向藥物提供依據(jù)。