一種核酸篩查系統(tǒng)在無償獻血檢測中的應(yīng)用價值

李俊英，王藝芳，葛文超，王頊，楊賀才，方建華

(河南省紅十字血液中心 檢驗科，河南 鄭州 450053)

血液核酸檢測(nucleic acid testing，NAT)是一種高度靈敏的血液傳染病檢測技術(shù)，能顯著縮短病毒感染檢測“窗口期”，檢出病毒變異以及免疫靜默的感染，降低輸血傳播病毒的風(fēng)險，是臨床用血安全的重要保障。隨著2015年底核酸檢測的全覆蓋，低濃度載量問題受到血液篩查實驗室的廣泛關(guān)注[1]，檢測系統(tǒng)的性能直接影響檢測結(jié)果的可靠性。本實驗室自2018年10月開始正式啟用浩源核酸篩查系統(tǒng)，為評估該系統(tǒng)在本實驗室的應(yīng)用效果，對運行以來7個月的檢測情況進行回顧性分析，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 標本來源選取2018年10月至2019年5月采集的57 434例鄭州地區(qū)無償獻血者血液標本，10例2019年衛(wèi)健委臨床檢驗中心(National Center for Clinical Laboratories，NCCL)核酸室間質(zhì)評標本，15例中國國際輸血感染預(yù)防和控制(China International Transfusion Infection Control，CITIC)核酸室間質(zhì)評標本。每位獻血者留取2管標本：1支酶免管(5 mL，EDTA抗凝)用于酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)和血型檢測，一支核酸管(5 mL，EDTA抗凝，帶分離膠)用于NAT檢測。所有標本的采集、運輸、和處理均嚴格按照《血站技術(shù)操作規(guī)程(2015版)》執(zhí)行。

1.2 主要試劑ELISA檢測試劑：HBsAg檢測試劑盒(珠海麗珠，批號2018061008、2018061208、2018112008等；北京萬泰，批號B20180622、B20180624、B20190103等)，抗-HCV 檢測試劑盒(珠海麗珠，批號20180914081、20181218081；北京萬泰，批號C20180821、C20180926、CS20181111等)，HIV Ag/Ab檢測試劑盒(法國伯樂，批號8F0438、8K0477、8M0453；北京萬泰，批號I20180716、I20181025、H20190101)。NAT試劑：HBV DNA、HCV RNA、HIV-1 RNA核酸檢測試劑盒(PCR熒光法)(上海浩源生物科技有限公司，批號MF20180101、MF20181105、MF20190101)。所有試劑均為中國藥品生物檢定所批檢合格產(chǎn)品，核酸檢測配套耗材由試劑公司提供，均在有效期內(nèi)使用。

1.3 主要儀器使用Hamilton Star全自動加樣儀(瑞士HAMILTON公司)和FAME 酶免分析儀(瑞士HAMILTON公司)進行ELISA檢測。使用ChiTas BSS 1200全自動核酸純化儀(上海浩源生物科技有限公司)、ABI 7500實時熒光定量PCR系統(tǒng)(美國ABI公司)和低溫大容量離心機KUBOTA 8730(日本KUBOTA公司)進行核酸檢測。所用儀器均經(jīng)過校驗，并在有效期內(nèi)。

1.4 檢測模式獻血者標本送至檢驗科后，當(dāng)日采用2個不同廠家的ELISA試劑進行平行檢測，次日從核酸標本管中挑除酶免雙側(cè)陽性的標本，剩余標本進行8混樣核酸檢測。每批實驗均設(shè)有1孔陽性對照、1孔陰性對照和1孔室內(nèi)質(zhì)控。室間質(zhì)評樣品按規(guī)定要求進行處理，和普通樣本一起上機檢測。

1.5 判定規(guī)則嚴格按照試劑盒說明書與標準操作規(guī)程(SOP)進行操作，通過軟件自動判讀結(jié)果，需人工復(fù)核。內(nèi)標Ct值>40或未檢測到判為無效，混檢結(jié)果無反應(yīng)性的pools判為NAT陰性，直接發(fā)布結(jié)果，有反應(yīng)性pools進行拆分檢測，以拆分結(jié)果為最終結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 核酸檢測有效拆分率和陽性率情況浩源核酸篩查系統(tǒng)共檢測57 434例核酸標本，混檢陽性pools數(shù) 69個，共拆出反應(yīng)標本37例，其中35個HBV DNA陽性標本，2個HIV RNA陽性標本(均由HBV DNA混pools拆出)，有效拆分率隨Ct值的升高而降低。見表1。

2.2 室間質(zhì)評數(shù)據(jù)2019年上半年浩源核酸篩查系統(tǒng)參加室間質(zhì)評共2次，10例NCCL標本檢測結(jié)果與參過結(jié)果一致；15例CITIC標本中3例陰性標本，HIV-1 RNA 和HCV RNA陽性樣本均能一次全部正確檢出；4例HBV DNA陽性標本首次檢測有3例未檢出，再次充分混勻后均檢測出來，HBV、HCV、HIV陽性標本每一種病毒均為4例相同濃度的樣品。見表2。

表1 浩源核酸篩查系統(tǒng)各月份NAT結(jié)果統(tǒng)計(n，%)

表2 15例CITIC室間質(zhì)評標本檢測結(jié)果

注：a試劑說明書標示的檢出限；b第二次檢測數(shù)據(jù)，第一次未檢出；—表示不適用。

2.3 檢測結(jié)果無效pools及設(shè)備故障共有59個結(jié)果無效pools和6次設(shè)備故障。室內(nèi)質(zhì)控HCV RNA未檢出造成的無效結(jié)果占比最大，內(nèi)標無效占比最少。見表3。6次設(shè)備故障中第1次為人為操作失誤所致，其他5次為設(shè)備運行中突發(fā)故障，并以D區(qū)液面感應(yīng)異常占比最大。見表3、4。

表3 NAT結(jié)果無效混樣pools的類型統(tǒng)計(%)

注：內(nèi)標無效(包括IC-DNA和IC-RNA)指Ct>40。

表4 6次設(shè)備故障統(tǒng)計

3 討論

《血站技術(shù)操作規(guī)程(2015版)》規(guī)定新的或經(jīng)過維修后可能影響檢測結(jié)果的檢測設(shè)備在正式投入正常使用之前應(yīng)經(jīng)過確認。本核酸實驗室在2018年引入浩源核酸篩查系統(tǒng)，在安裝確認之后進行了檢測通量、壓力測試和試劑分析靈敏度等一系列性能驗證，達到了預(yù)期要求。通過對該系統(tǒng)日常檢測結(jié)果的回顧性分析，對其檢測性能進行進一步了解。

2018年10月至2019年5月浩源核酸篩查系統(tǒng)核酸總陽性檢出率為0.06%，稍低于本中心羅氏系統(tǒng)，高于科華系統(tǒng)[2]及河北地區(qū)報道的浩源系統(tǒng)[3]。浩源核酸篩查系統(tǒng)有效拆分率為49.28%，低于羅氏系統(tǒng)，高于科華系統(tǒng)[2]，與其他地區(qū)報道的達安有效拆分率(51.72%)相近[4]。本研究結(jié)果顯示2018年10月核酸陽性率最高，2018年12月和2019年2月核酸陽性率最低，可能是10月份剛投入使用，工作人員對操作不夠熟悉，存在一定的假陽性。12月和 2019年2月該系統(tǒng)檢測量較少，數(shù)據(jù)可能有偏差，或由于檢測過程的某個環(huán)節(jié)操作不當(dāng)引入的污染所致或是檢測的非特異性反應(yīng)結(jié)果。2019年3月隨著浩源核酸篩查系統(tǒng)逐步開展，實驗室人員的熟練操作程度也逐漸提升，設(shè)備運行性能、檢測結(jié)果均較穩(wěn)定，其有效拆分率逐漸提高，對應(yīng)的陽性檢出率也較穩(wěn)定。69個混檢陽性pools的Ct值大多數(shù)處于36～38，且隨著混pools Ct值的升高，相應(yīng)的拆分率降低，這和研究報道中隨著混檢Ct值的增大，拆分陽性符合率逐漸下降是一致的[5]。檢測出的2個HIV RNA陽性標本，均是由HBV DNA混檢陽性pools拆分出來，Ct值>39，對兩者半年后重新抽樣檢測，結(jié)果NAT和ELISA均為陰性，由此可斷定此HIV RNA為假陽性。混檢為陽性反應(yīng)，而拆分無反應(yīng)性的標本，大都是污染所致的假陽性或非特異性結(jié)果，因此日常操作時要嚴格按照標準操作規(guī)程，多注意細節(jié)操作，同時也期待檢測試劑的特異性進一步提高，以便更好地保證檢測結(jié)果的準確性。

浩源核酸篩查系統(tǒng)共檢測混樣pools 7 242個，總pools無效率為0.81%(59/7 242)，低于本實驗室羅氏系統(tǒng)[6]和華益美系統(tǒng)[7]。其中室內(nèi)質(zhì)控HCV RNA未檢出所致的無效pools占比最大，可能為儀器加樣量不足或是HCV RNA發(fā)生降解所致，這就要求工作人員要正確使用和處理室內(nèi)質(zhì)控品，防止樣品受到核酶污染。儀器未加上結(jié)合液導(dǎo)致無效pools占比次之，是由于加樣模塊第8通道有異物阻塞，系統(tǒng)軟件漏洞未報警而未能及時采取人工干預(yù)所致，因此工作人員在實驗運行期間定要嚴密觀察，防止漏加、少加液體，并建議系統(tǒng)后期進行軟件升級，增加加樣的感應(yīng)功能，以防類似現(xiàn)象再次發(fā)生。2個內(nèi)參無效pools均是Ct值>40，推測為樣本含有抑制物或儀器誤差導(dǎo)致內(nèi)標加樣量不足。3個pools HIV RNA擴增曲線異常，可能為擴增反應(yīng)孔的本底信號干擾或反應(yīng)液混勻、離心時間不足，因此配制擴增反應(yīng)液后要充分震蕩混勻，如模板中有磁珠殘留，更要充分離心。

運行期間設(shè)備故障共計6次，其中1次屬人為操作失誤，針對此現(xiàn)象已對工作人員重新進行了儀器操作培訓(xùn)，要求工作人員實驗中要嚴謹細心，規(guī)范操作，盡量減少人為誤差。5次故障發(fā)生在系統(tǒng)運行的前2個月內(nèi)，可能為開始運行階段，工作人員對操作不夠熟悉，設(shè)備性能不夠穩(wěn)定，隨著檢測的開展，設(shè)備性能逐漸平穩(wěn)，故障次數(shù)也逐步減少。另外，需要工作人員留心設(shè)備在加樣過程中偶有液面探測異常而空加液體的現(xiàn)象，工作人員在設(shè)備運行期間務(wù)必細心觀察，嚴防漏加，并做好設(shè)備的日常維護、校準工作，以保證檢測過程的順利進行和結(jié)果的準確性。

2次室間質(zhì)評結(jié)果，10個NCCL樣品的檢測結(jié)果與參考結(jié)果一致，15個CITIC樣品中，HCV RNA和HIV RNA檢測結(jié)果的CV分別為2.04%、0.92%，說明本次RNA檢測的結(jié)果穩(wěn)定、重復(fù)性較好。3例首次混檢為HBV DNA陰性的樣品，次日將樣本充分顛倒混勻再次混檢，結(jié)果3例樣本均能檢出HBV DNA，4份結(jié)果的CV為9.63%。分析原因為：浩源核酸篩查系統(tǒng)做室間質(zhì)評樣本前，該系統(tǒng)停用了兩周，再次啟用可能設(shè)備性能及狀態(tài)不穩(wěn)，以及第1次樣本顛倒混勻后，未及時檢測，中間放置1 h左右；可能工作人員放置磁珠條時未將其分混勻，影響了對靶基因的捕獲效率；樣品濃度低于系統(tǒng)檢出限，結(jié)果會出現(xiàn)一定概率的非反應(yīng)性，而對樣本充分顛倒混勻可使病毒分布均勻，有助于提高檢出率；系統(tǒng)對低濃度HBV的檢出效果有待進一步評估。

綜上所述，通過對浩源核酸篩查系統(tǒng)運行以來的回顧性分析，顯示其能夠從ELISA陰性標本中篩查出核酸陽性標本，進一步保障了血液安全，同時該系統(tǒng)在運行中也存在一些問題和需改進的地方。由于目前該設(shè)備運行時間不長，檢測量不夠大，各項數(shù)據(jù)可能會存在一定的偏差，日后將通過進一步的數(shù)據(jù)積累，更客觀、全面地評估其核酸檢測效果，也期待核酸檢測系統(tǒng)可以進一步完善，提高檢測性能。