熒光定量PCR在念珠菌性陰道炎診斷中的應用價值

羅翔宇

(禹州市婦幼保健院 檢驗科，河南 許昌 461670)

陰道炎是女性高發的一種婦科病，患者多因細菌性感染發病，多種細菌均可誘發陰道感染，因此臨床治療女性細菌性陰道炎前需鑒別出感染細菌種類[1]。臨床發現念珠菌是細菌性陰道炎的主要致病菌之一，且復發率較高，對患者生活影響較大。細菌培養法是常規診斷細菌性陰道炎的方法，耗時較長，不利于及時治療。熒光定量PCR是新型PCR檢測技術，快速高效[2]。本研究旨在探討熒光定量PCR在念珠菌性陰道炎診斷中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2017年8月至2019年8月禹州市婦幼保健院接收的62例疑似陰道炎患者，年齡29～57歲，平均(42.86±7.26)歲，病程3～8個月，平均(5.83±1.24)個月。所有患者均接受陰道分泌物核酸雜交法檢測，結果作為金標準。排除真菌感染患者。患者自愿參與本研究并簽署知情同意書。本研究經禹州市婦幼保健院醫學倫理委員會批準。

1.2 檢測方法

1.2.1熒光定量PCR 使用無菌性棉簽蘸取患者陰道分泌物，使用美國Bio-Rad伯樂實時熒光定量PCR儀(規格：CFX384 Touch)及其配套的試劑盒、器皿，將患者陰道分泌物和生理鹽水混合成1 000 μL，1 500 r·min-1離心15 min，靜置10 min后去除上層清液，加入組織裂解液，60 ℃水育15 min，再次1 500 r·min-1離心15 min，取上層清液進行PCR擴增。反應體系：2×蒸餾水55 μL、10×反應緩沖液(北京博爾邁生物科技有限公司)10 μL、4×dNTPs(各1.25 mmol·L-1，由賽默飛世爾科技有限公司提供)16 μL，上海博雅生物技術有限公司提供的DNA模板10 μL，Taq聚合酶0.5 μL。將反應體系配置好后置于實時熒光定量PCR儀上，設置參數：以94 ℃ 60 s；37 ℃ 60 s，72 ℃ 120 s順序依次進行，循環30次后使用瓊脂糖凝膠電泳觀察結果，與陽性對照樣本和陰性對照樣本對比。陽性診斷標準：條帶寬度≤1 mm，并在預期堿基范圍內，背景無藥斑或引物二聚體。在預期堿基范圍之外為假陽性。

1.2.2細菌培養法 將采集的患者陰道分泌物置于干凈的細菌培養皿中，加入適量的細菌培養液，然后置于細菌培養箱中，溫度設置為32 ℃，濕度為50%，培養48 h后使用融智生物科技青島有限公司提供的微生物鑒定質譜系統(規格：Quan TOFⅠ/Ⅱ)進行細菌鑒定。陽性診斷標準：48 h后器皿內出現典型菌落，鑒定為念珠菌。

1.3 統計學方法采用SPSS 20.0統計軟件進行數據處理。計數資料以頻數和率(%)表示，組間比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 檢測結果62例患者經陰道分泌物核酸雜交法檢測診斷出念珠菌性陰道炎48例，其他類型細菌感染14例，檢出率為77.42%；熒光定量PCR檢出念珠菌性陰道炎46例，其他類型細菌感染11例，誤診5例，檢出率為74.19%；細菌培養法檢出念珠菌性陰道炎34例，其他類型細菌感染8例，誤診20例，檢出率為54.84%。熒光定量PCR檢出率與核酸雜交法診斷檢出率比較，差異無統計學意義(χ2=0.176，P=0.675)；熒光定量PCR檢出率高于細菌培養法，差異有統計學意義(χ2=5.072，P=0.024)。見表1、2。

表1 熒光定量PCR診斷結果(n)

表2 細菌培養法診斷結果(n)

2.2 診斷價值熒光定量PCR檢測的靈敏度、特異度、準確性[95.83%(46/48)、78.57%(11/14)、91.94%(57/62)]均高于細菌培養法[70.83%(34/48)、57.14%(8/14)、67.74%(42/62)](均P<0.05)。

3 討論

念珠菌性陰道炎是臨床較常見的一種陰道炎類型，常伴有外陰瘙癢、尿痛、白帶增多、分泌物異味等臨床癥狀，對患者生活影響較大[3]。細菌培養法是目前臨床運用較為廣泛的一種細菌鑒別技術，可以鑒別感染性疾病的菌群種類，但臨床耗時較長，往往需要2～3 d才能得出診斷結果，不能滿足臨床治療要求。熒光定量PCR診斷技術是由傳統PCR技術發展而來的一種新型診斷技術，應用廣泛，可對多種病原菌進行診斷，效果較好[4]。

本研究中熒光定量PCR檢出率與核酸雜交法診斷檢出率相近，熒光定量PCR檢出率、靈敏度、特異度、準確性均高于細菌培養法，表明相對比細菌培養法，熒光定量PCR診斷念珠菌性陰道炎效果更好，結果更準確，臨床應用價值更高。熒光定量PCR在檢測過程中，將熒光基團加入PCR反應體系中，利用熒光信號積累對整個PCR進程進行實時檢測，然后與標準曲線進行對比得出檢測結果。熒光定量PCR對樣本量要求較低，無需過多的樣本容量，檢測靈敏度、特異度均較高，且檢測耗時短，當天即可獲得檢測結果，從而縮短檢測結果等待時間，可及時進行治療[5]。與傳統的PCR技術相比，無PCR后續操作流程，降低產物污染的風險性，同時熒光定量PCR具有數千種細菌的熒光對照譜，對念珠菌的特異度較高；而細菌培養法易受到外部細菌的影響，造成診斷結果誤差，對念珠菌的特異度并不高；而對于部分細菌培養法無法進行培養或培養要求較高的特殊菌種，熒光定量PCR檢測也提供了新的思路，為臨床診斷提供新的診斷方法，臨床醫生可靈活選擇運用。因此，熒光定量PCR的診斷結果較可靠，但對操作人員的素質要求較高，需熟悉各項流程的操作事項[6]。

綜上所述，熒光定量PCR診斷念珠菌性陰道炎效果較好，值得臨床推廣應用。