加味滌痰湯對腦缺血再灌注損傷大鼠腦細胞自噬的特異性

陳維達 劉曉婷 陳澤濤

(1山東中醫藥大學，山東 濟南 250355；2山東中醫藥大學附屬醫院；3濰坊市中醫院)

缺血性腦卒中是腦血管病最常見的一種類型，占全部腦卒中的60%～80%〔1〕，中醫方面又稱“中風”。它導致的神經功能障礙常對患者的生活質量造成嚴重影響，且發病率、致殘率、復發率極高。滌痰湯出自《濟生方》,有益氣祛痰、化濁開竅的功能，是治療急性期缺血性腦卒中的有效方劑。劉曉婷等〔2〕研究發現，加味滌痰湯灌胃對缺血再灌注(CIR)損傷大鼠神經功能有保護作用，但并未詳細探討滌痰湯對CIR損傷關于自噬方面的具體機制。已有研究表明〔3〕，自噬在CIR損傷中具有重要作用。自噬不僅參與細胞死亡，同時也是細胞在惡劣環境中維持自我內環境穩定的一種保護機制。本文通過對大鼠進行右側大腦中動脈栓塞(MCAO)構建CIR模型，探討加味滌痰湯對CIR損傷大鼠腦細胞自噬的影響。

1 材料與方法

1.1材料 2016年2月至2017年2月選取SPF級雄性SD大鼠90只(北京維通利華實驗動物技術有限公司提供)，體重140～160 g。加味滌痰湯方藥組成：膽南星 12 g、石菖蒲10 g、橘紅10 g、梔子10 g、枳實10 g，半夏9 g，水蛭6 g、生大黃6 g；采用北京康仁堂藥業全成分中藥配方顆粒，每劑 9.6 g。吡拉西坦片(山東仁和堂藥業有限公司生產，批號 20160122，劑量：0.4 g/片)。Western印跡主要試劑見表1。

1.2構建CIR損傷模型 術前禁食、禁水6 h。以10%水合氯醛(3.5 ml/kg)麻醉大鼠，麻醉滿意后，參照Clark等〔4〕的方法，對大鼠進行可逆性MCAO線栓法栓塞右側大腦中動脈，縫合皮膚切口。術中以加熱板保持大鼠肛溫在37℃左右。假手術組除不插入線栓外余手術過程相同。缺血90 min后拔出栓線進行CIR，90 min 后參照Longa等〔5〕制定的標準對大鼠進行神經功能障礙評分。本實驗選用神經功能評分為1～3分進行右側MCAO成功的大鼠和0分的假手術大鼠。

表1 Western印跡主要試劑

LC3-Ⅱ:自噬相關蛋白微管相關蛋白1輕鏈Ⅱ

1.3實驗分組 實驗共分為5組：假手術組隨機納入假手術大鼠5只；模型組、中藥高劑量組、中藥低劑量組、西藥組各隨機納入造模成功的CIR損傷的大鼠各5只。

1.4方法 于造模成功后24 h給藥，1次/d，連續給藥7 d，中藥高劑量組給予加味滌痰湯0.768 g/(kg·d)，中藥低劑量組給予加味滌痰湯0.384 g/(kg·d)，西藥組給予吡拉西坦片0.1 g/(kg·d)，假手術組與模型組給予等量的生理鹽水，灌胃容積為10 ml/kg。于給藥周期結束24 h內，每組取5只大鼠采用Western印跡測定腦組織中LC3-Ⅱ、Beclin1、Bcl-2的表達。

1.5統計學方法 采用SPSS20.0統計軟件進行單因素方差分析、LSD-t法。

2 結 果

2.1用藥后各組腦組織LC3-Ⅱ、Beclin 1、Bcl-2的表達 與假手術組比較，模型組缺血腦組織中LC3-Ⅱ、Beclin 1、Bcl-2表達顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，中藥高劑量組、低劑量組及西藥組LC3-Ⅱ、Bcl-2表達均顯著降低(P<0.05)。中藥高劑量組及西藥組Beclin1表達顯著下降(P<0.05)，見圖1、表2。

1～5：假手術組、模型組、中藥高劑量組、中藥低劑量組、西藥組圖1 用藥后各組腦組織LC3-Ⅱ的表達

表2 各組Bcl-2、Beclin1、LC3-Ⅱ表達比較

與假手術組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05

3 討 論

滌痰湯是腦卒中急性期治療的傳統方劑，具有滌痰開竅之功效。近年來，在缺血CIR動物模型與體外細胞培養等方面的研究進一步明確了滌痰湯藥理作用的機制。張勇等〔6〕將CIR損傷大鼠MCAO隨機分組，結果顯示術后72 h滌痰湯組較模型組神經功能缺損程度顯著改善，腦組織受損程度明顯減輕。劉玲等〔7〕用同樣的方法進行研究，發現術后72 h滌痰湯組缺血側腦組織細胞凋亡率明顯降低，表明滌痰湯的神經保護作用可能與抑制缺血后細胞凋亡有關。本研究采用的加味滌痰湯是在滌痰湯基礎上化裁而來，治療腦卒中急性期痰瘀互結、化熱動風者。

自噬是真核細胞利用溶酶體對衰老、過剩的生物大分子(如蛋白質)及受損的細胞器進行分解代謝的過程〔8〕。既往研究證明〔9〕，缺血缺氧是自噬激活的重要誘因之一。自噬過程由一系列自噬相關蛋白(Atg蛋白)介導完成，LC3是自噬體膜上的標記蛋白。LC3-Ⅱ被用來作為自噬體的標記，其水平在某種程度上反映了自噬體的數量〔10〕。本研究結果表明，在缺血CIR發生發展的病理過程中自噬機制參與其中，且自噬是被激活的，這與既往研究結果相同〔9〕。另外，LC3-Ⅱ表達的降低反映出自噬受到抑制。因此，CIR發生后自噬加劇缺血后的腦損傷；加味滌痰湯能減輕CIR后的腦損傷，其機制與抑制CIR損傷后發生的自噬有關。

Beclin1基因是哺乳動物參與自噬的特異性基因，是形成自噬體的必需分子，在一定程度上可代表自噬的活性，能夠調節自噬體膜合成和物質轉運。Bcl-2家族是一組結構域的高度同源蛋白系列，在細胞凋亡中起重要調節作用。Bcl-2作為經典的抗凋亡蛋白，在調控細胞自噬的過程中也有重要作用。此外，Bcl-2還能通過多種機制調控氧化應激，而氧化應激在誘導自噬和凋亡中均發揮作用〔11,12〕。當細胞內環境穩定時，Beclin1與Bcl-2家族蛋白持續結合，并抑制自噬的發生。Bcl-2蛋白能阻止Beclin1蛋白與調控因子Ⅲ型磷脂酰肌醇3激酶(PI3KC3)特異性結合，或減少PI3KC3磷酸化活性而起到抑制自噬的作用。當細胞發生饑餓或應用自噬誘導劑使自噬增強時，繼而發生Beclin1與Bcl-2的解聚〔13〕，使Beclin1依賴的自噬增加，提示Bcl-2對自噬起抑制作用。由此可見，自噬與凋亡之間存在復雜的調控關系，而Beclin1與Bcl-2的平衡狀態則是調控自噬與凋亡互反饋作用的關鍵因素。

本研究結果說明，在缺血缺氧條件下，機體通過上調Beclin1的表達來誘導自噬的激活；同時，Bcl-2表達的升高表明抗凋亡作用的增強。目前普遍認為自噬和凋亡在特定情況下可以相互轉化，共同促進細胞死亡。自噬抑制凋亡的主要機制是線粒體自噬，線粒體受損時細胞內的自噬激活因子會被激活，使細胞啟動自噬來挽救細胞，自噬就會對受損的線粒體進行捕捉并將其降解消除，以防止細胞發生凋亡〔14〕。本研究表明，中藥高劑量組能有效抑制自噬；且高劑量組優于低劑量組，表明存在量效關系，高劑量能更有效抑制自噬的發生。

綜上，加味滌痰湯能通過干預腦缺血CIR損傷后的自噬，調節自噬活性，抑制LC3-Ⅱ、Beclin1的表達，有效下調自噬，起到缺血CIR后神經保護的作用。但自噬發生的機制及調節通路十分復雜，本文僅就加味滌痰湯對自噬的影響做了研究，至于其發揮神經保護的分子機制、確切的調節通路及如何調控自噬與凋亡的發生等問題，有待進一步研究。