甘草酸抑制PI3K/AKT/NF-κB減輕膠原誘導型類風濕關節炎大鼠炎癥反應

胡志平 何紹前 王傳明 鄧瑩 魏學軍

(黔南民族醫學高等專科學校，貴州 都勻 558025)

類風濕關節炎發病原因不明，屬全身性自身免疫病，可由感染、免疫、內分泌失調、環境因素等引發，慢性炎癥侵襲小關節致關節受累，滑膜增生，嚴重者關節畸形，生活質量明顯被影響〔1〕。西南地區地處云貴高原，氣候潮濕，類風濕關節炎發病頻繁。治療此病的藥物多集中于非甾體類抗炎藥、免疫抑制劑、激素等，副作用也比較突出，所以尋找有效的抗炎治療藥物較為棘手〔2～4〕。甘草作為中藥中補益類品種，有補虛解百毒之功效，含甘草酸、甘草次酸等活性成分，文獻稱甘草酸有類激素樣作用，是否對類風濕疾病有治療作用未曾確認。因此，本文采用膠原誘導型關節炎(CIA)大鼠模型作為類風濕疾病模型，初步探討甘草酸對類風濕關節炎藥效及干預機制。

1 材料與方法

1.1試驗藥物 甘草酸標準品(純度≥98%)購自北京索萊寶科技有限公司，用1%羧甲基纖維素鈉調整到所需濃度。美洛昔康片(批號：284792)上海勃林格殷格翰藥業有限公司提供。

1.2動物 SPF級雄性SD大鼠，180～220 g，長沙天勤生物技術有限公司提供，動物許可證號：SCXK(湘)-2014-0011。

1.3試劑 β-actin、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、磷酸化(p)-蛋白激酶B(AKT)、核轉錄因子(NF)-κBp65、p-NF-κBp65蛋白，貨號#8457、#4257、#4060、#8242、#3033購自CST公司。IκB-α、IKK-α蛋白，貨號ab32518、ab32041，購自Abcam公司。牛Ⅱ型膠原，批號31055，購自Chondrex公司。完全弗氏佐劑，批號F6005，購自Sigma公司。山羊抗兔HRG抗體，批號109525，購自北京中杉金橋生物技術有限公司。SDS-PAGE凝膠制備試劑盒，貨號G1120，購自北京索萊寶生物科技有限公司。白細胞介素(IL)-1β、C反應蛋白(CRP)、腫瘤壞死因子(TNF)-α、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(貨號tw039569、TWp002822、TWp002859)購自上海通蔚實業有限公司。

1.4儀器 石蠟切片機，購自浙江科迪儀器設備有限公司。光學顯微鏡，購自日本Olympus公司。足趾容積測量儀，購自上海欣軟信息科技有限公司。

1.5方法 SD大鼠若干只隨機分為空白組和模型組〔5〕，模型組于第1天和第10天尾根部皮內注射牛Ⅱ型膠原與完全弗氏佐劑體積比1∶1混懸液0.2 ml。致炎后觀察足跖關節腫脹度程度，選取雙后肢足跖完全腫脹的大鼠，隨機分為模型組、美洛昔康組(2 mg/kg)、甘草酸低(60 mg/kg)、中(80 mg/kg)、高(100 mg/kg)劑量組，每組10只。空白組灌胃給予等體積蒸餾水，其余各組用羧甲基纖維素鈉調配成相應劑量藥物的混懸液灌胃，連續給藥42 d。末次給藥后檢測每組足跖部容積，取脾臟分別放入4%多聚甲醛和取同側滑膜-80℃低溫保存備用。

1.5.1足跖部腫脹度測定 容積測量儀測量各組雙后肢足跖部炎癥誘導前和炎癥誘導后每周腫脹度(腫脹度=炎癥誘導后容積-炎癥誘導前容積)，記錄并統計分析。

1.5.2免疫組化SP法檢測脾臟IKK-α、IκB-α、NF-κBp65蛋白表達 70%、80%、90%、100%乙醇分別脫水2 h；二甲苯透明20 min；液體石蠟中浸蠟2次，每次1.5 h；包埋、切片；制作好的切片常規二甲苯脫蠟2次15 min；100%、90%、80%、70%乙醇水化；蒸餾水浸泡1 min；磷酸鹽緩沖液(PBS)浸泡1 min后3%過氧化氫封閉10 min，阻斷內源性過氧化物酶；PBS沖洗后滴加Ⅰ抗，濃度比例為1∶100；4℃孵育后滴加Ⅱ抗，濃度比例為1∶200；二氨基聯苯胺(DAB)顯影后，自來水沖洗，復染，脫水，透明并封片，分析結果。

1.5.3Western印跡檢測關節滑膜PI3K、p-AKT、p-NF-κBp65蛋白表達 根據聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白定量試劑盒要求蛋白定量后，十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)制備試劑盒制備12%的分離膠和5%的濃縮膠，5%濃縮膠上樣后電泳40 min，12%分離膠電泳1.5 h，轉膜2 h，5%脫脂奶粉封閉2 h后加Ⅰ抗，內參Ⅰ抗1∶ 8 000、其他Ⅰ抗1∶1 000，加入Ⅱ抗1∶10 000，TBST沖洗3次，顯影液顯影，拍照后分析結果。

1.5.4ELISA試劑盒檢測IL-1β、CRP、TNF-α 腹主動脈取大鼠血漿，3 000 r/min離心15 min，取上清液，根據試劑盒要求，制定好標準曲線后，按試劑盒操作步驟進行。

1.6統計學方法 采用SPSS17.0統計學軟件進行t及秩和檢驗。

2 結 果

2.1各組足跖部腫脹度比較 與空白組比較，模型組大鼠足跖腫脹容積明顯增大(P<0.01)。與模型組比較，炎癥誘導第5、6周甘草酸高、中、低劑量組、美洛昔康組具有明顯抑制炎癥腫脹的作用，差異有統計學意義(P<0.01或P<0.05)。見表1。

2.2甘草酸對CIA脾臟IKK-α、IκB-α、NF-κBp65蛋白表達影響 與模型組比較，空白組、甘草酸高、中、低組、美洛昔康組IKK-α、IκB-α、NF-κBp65蛋白平均光密度值表達顯著下降,差異有統計學意義(P<0.01或P<0.05)。見表2，圖1～3。

表1 炎癥誘導后不同時間各組足跖部腫脹度比較

續表1 不各組足跖部腫脹度比較

與模型組比較:1)P<0.05,2)P<0.01，下表同

表2 甘草酸對CIA脾臟IKK-α、IκB-α、NF-κBp65蛋白平均光密度值影響

圖1 甘草酸對CIA大鼠脾臟IKK-α蛋白表達的影響(DAB，×400)

圖2 甘草酸對CIA大鼠脾臟IκB-α蛋白表達的影響(DAB，×400)

圖3 甘草酸對CIA大鼠脾臟NF-κBp65蛋白表達的影響(DAB，×400)

2.3各組血漿IL-1β、CRP、TNF-α表達比較 與模型組比較，甘草酸對血漿中IL-1β、CRP、TNF-α炎性因子表達均呈下調趨勢，表明甘草酸有一定的抑炎作用。見表3。

2.4甘草酸對CIA關節滑膜PI3K、p-AKT、p-NF-κBp65蛋白表達影響 與模型組相比，甘草酸各劑量組、美洛昔康組PI3K、p-AKT、p-NF-κBp65蛋白表達量被受到不同程度抑制，表明甘草酸能夠抑制關節滑膜內PI3K、p-AKT、p-NF-κBp65蛋白過表達。見表3，圖4。

表3 甘草酸對血漿IL-1β、CRP、TNF-α及CIA關節滑膜PI3K、p-AKT、p-NF-κBp65蛋白表達的影響

1～6:空白組，模型組，美洛昔康組，甘草酸低劑量組，甘草酸中劑量組，甘草酸高劑量組圖4 甘草酸對CIA關節滑膜中PI3K、p-AKT、p-NF-κBp65蛋白表達的影響

3 討 論

類風濕關節炎作為慢性自身免疫性疾病，反復滑膜炎侵蝕關節軟骨與骨組織，造成持續性骨質破壞，最終導致骨關節畸形，致殘率較高，臨床治療也比較棘手。目前，臨床針對此病的治療一般多以緩解炎癥為主，嚴重者佐以激素治療。抗炎藥可誘發胃腸潰瘍及骨髓再生抑制等副作用，激素則容易引發庫欣綜合征等副作用。有多靶點抗風濕作用的中藥、中成藥、中藥復方、中藥單體成分在治療類風濕關節炎方面取得較好的療效，用藥安全性有明顯優勢優于常規化學藥物，因此日益受到重視〔5，6〕。本實驗結果表明，甘草酸干預后能明顯減輕足跖關節炎性腫脹的情況。類風濕性關節炎誘導的過程中，作為自身免疫性疾病，體液免疫和細胞免疫交互作用，病灶區異常激活大量炎癥因子，CRP是機體非特異性免疫機制的一部分，它在Ca2+存在時可結合細胞膜上磷酸膽堿激活補體，增強白細胞的吞噬作用，調節淋巴細胞或單核/巨噬系統功能，促進巨噬細胞組織因子的生成。單核-巨噬細胞大量分泌IL-1α和β，進而激活T細胞活化，B細胞激活。TNF-α和β，前者來自單核-巨噬細胞，后者由活化T細胞產生，造成IL-1β、TNF-α等參與類風濕關節炎病理發病過程〔7〕。服用甘草酸后可顯著抑制類風濕關節炎體內IL-1β、CRP、TNF-α的過表達〔8,9〕。PI3K/Akt/NF-κB信號通路在正常生理反應和炎癥進程中發揮著不同作用,包括促進細胞的增殖、生存和分化等。PI3K/Akt通路激活后,活化的Akt通過增強NF-κB抑制蛋白IκB激酶的磷酸化、降解,繼而導致NF-κB的活化。PI3K/AKT/NF-κB信號通路作為T細胞、B細胞炎性信號通路中的交會點，其標志蛋白IKK-α、IκB-α、NF-κBp65、PI3K、p-AKT、p-NF-κBp65在類風濕關節炎大鼠模型中表達增強。這些標志蛋白經甘草酸干預后表達被明顯抑制。本實驗表明甘草酸口服有效控制CIA大鼠關節炎癥，可能與該藥抑制血液中IL-1β、CRP、TNF-α因子的釋放繼而抑制PI3K/AKT/NF-κB信號通路途徑中關鍵蛋白IKK-α、IκB-α、NF-κBp65、PI3K、p-AKT、p-NF-κBp65蛋白的過表達有關。