miR-107-3p靶向SLC25A38調控阿爾茨海默病模型細胞凋亡的分子機制

祁英杰 朱竹君 張歡妍 于明

(江蘇大學附屬金壇醫院 1神經內科，江蘇 常州 213200；2檢驗科；3江蘇大學附屬醫院神經內科)

微小核糖核酸(miRNA)由18～25個核苷酸組成，內源性穩定，可直接降解mRNA及轉錄后阻斷靶基因的翻譯，通過這些過程，miRNAs調節了各種生理功能，包括阿爾茨海默病(AD)的發生和發展〔1,2〕。然而，關于miRNA在AD中的作用知之甚少。miR-107雖在AD中具有重要的調控功能，但是其作用機制尚未完全清楚。膜轉運蛋白的溶質載體(SLC)25位于線粒體內膜上，因此被稱為線粒體載體〔3，4〕。SLC25是一個結構和功能相關的蛋白質家族，包含6個α-螺旋跨膜區域〔5〕。SLC25成員蛋白由核基因編碼并在胞質溶膠中合成，新合成的蛋白質隨后易位到線粒體的內膜中運輸各種底物，如細胞質和線粒體基質之間的代謝物(核苷酸和輔因子)，SLC25A38屬于SLC25家族〔6〕。本研究擬探討miR-107-3p與SLC25A38在AD中的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞PC12購自中國科學研究院細胞庫；RPMI1640培養基購自武漢純度生物公司；胎牛血清購自江蘇寶萊生物公司；噻唑藍(MTT)試劑購自河南華美生物工程有限公司；胰蛋白酶購自美國Sellect公司；LipofectamineTM2000購自上海陽光生物工程有限公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購自上海生工生物工程股份有限公司；逆轉錄試劑盒購自日本TaKaRa公司；電化學發光(ECL)液購自北京普利萊基因技術有限公司；放射免疫沉淀法(RIPA)蛋白裂解液購自上海貝博生物科技公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自上海碧云天研究所；Annexin V-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑盒購自南寧諾唯贊生物科技有限公司。

1.2細胞的培養及AD模型的建立 將PC12細胞用RPMI1640培養基在37℃、5% CO2的培養箱中進行細胞的常規培養、傳代，標記為對照組。參照喬娜娜等〔7〕的方法建立AD細胞模型，標記為模型組。

1.3細胞的轉染 調整模型組細胞至105個/ml，按照LipofectamineTM2000脂質體試劑說明書要求操作，取4倍DNA或質粒量的脂質體進行miR-NC、miR-107-3p mimics、si-NC、si-SLC25A38、miR-107-3p+pcDNA、miR-107-3p+pcDNA-SLC25A38的轉染，將其轉染至模型組細胞中，先轉染6 h，再更換新鮮的培養基繼續培養48 h，用實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測轉染的效率，確認轉染成功后依次標記為模型+miR-NC組、模型+miR-107-3p組、模型+si-NC組、模型+si-SLC25A38組、模型+miR-107-3p+pcDNA組、模型+miR-107-3p+pcDNA-SLC25A38組，用于后續試驗。

1.4qRT-PCR法檢測細胞中miR-107-3p、SLC25A38的表達 收集細胞，用Trizol液提取總RNA，然后盡快用逆轉錄試劑盒將其合成cDNA。最后用qRT-PCR試劑盒進行miR-107-3p、SLC25A38的檢測。以U6、β-actin為內參，用2-△△Ct計算miR-107-3p、SLC25A38的表達。miR-107-3p上游引物ATGATGAGCAGCATTGTACAGG，下游引物GCAGGGTCCGAGGTATTC；U6 上游引物CTCGCTTCGGCAGCACA，下游引物AACGCTTCACGAATTTGCGT；SLC25A38上游引物GTCGGAGACGCGGTGGAAAC，下游引物GCCAACATCCCAACACGTGTA；β-actin上游引物GACCTCTATGCCAACACAGT，下游引物AGTACTTGCGCTCAGGAGGA。

1.5Western印跡檢測細胞中SLC25A38的蛋白表達 收集細胞，加入裂解液使細胞充分裂解，提取總蛋白并定量。用十二烷基硫酸鈉(SDS)上樣緩沖液稀釋后進行沸水浴變性，取其上清液進行蛋白電泳上樣。電泳時先穩壓電泳約50 min，再進行穩流電泳約1 h，結束后，小心取出蛋白膠，避免膠破損。將膠上的蛋白用轉膜儀轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，在轉膜過程中必須保證整個操作環境的低溫狀態(0～4℃)。轉膜后，將膜用5%的脫脂奶粉封閉處理2 h，結束后再將膜小心轉移至稀釋好的Ⅰ抗溶液中，4℃孵育過夜。取出膜浸入稀釋好的Ⅱ抗溶液中，37℃孵育 2 h。結束后，將膜用ECL液進行顯影、曝光，所得圖像用Image J分析條帶的灰度值，用目的條帶灰度值與內參條帶灰度值的比值反映目的蛋白的表達。

1.6MTT法檢測細胞存活率 收集細胞，調整至5×105個/ml，取100 μl接種至96孔板，按照MTT試劑使用要求操作，每孔加MTT溶液、二甲基亞砜(DMSO)，避光輕輕震蕩使結晶發生融解。最后在酶標儀上設置490 nm波長，檢測細胞的吸光度(A)。細胞的存活率=A490樣品/A490對照×100%。

1.7Annexin V-FITC/PI流式細胞術實驗 收集細胞，用適量結合緩沖液懸浮細胞，按Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒要求，依次加入Annexin V-/FITC、PI均進行避光反應，結束后立即上流式細胞儀進行細胞凋亡的檢測分析。細胞凋亡率(%)=早期凋亡率+晚期凋亡率。每個樣品重復3次。

1.8雙熒光素酶報告基因檢測實驗檢測細胞的熒光活性 首先構建突變型(WT)和野生型(MUT)SLC25A38基因〔SLC25A38 3′非翻譯區(UTR)MUT和SLC25A38 3′ UTR WT〕將其克隆至載體psiCHECK2，構建psiCHECK2-SLC25A38 WT和psiCHECK2-SLC25A38 MUT熒光載體質粒。再將其通過脂質體法分別與miR-NC、miR-107-3p共轉染至PC12細胞。按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書操作，進行細胞裂解、加入底物，結果以螢火蟲熒光素酶活性為內參，海腎熒光素酶的熒光強度與螢火蟲熒光強度的比值反映細胞的熒光活性。

1.9統計學分析 采用GraphPad Prism6.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗、t檢驗。

2 結 果

2.1miR-107-3p、SLC25A38在AD細胞模型中的表達 與對照組比較，模型組miR-107-3p表達顯著降低，SLC25A38 mRNA和蛋白表達均顯著升高(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 對照組和模型組SLC25A38蛋白表達

表1 miR-107-3p和SLC25A38在AD細胞模型中的表達

2.2過表達miR-107-3p對AD細胞存活率的影響 與對照組比較，模型組miR-107-3p表達顯著降低，細胞存活率顯著降低(P<0.05)；與模型+miR-NC組比較，模型+miR-107-3p組，miR-107-3p表達及細胞存活率顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 miR-107-3p過表達對AD細胞存活率及細胞凋亡的影響

與對照組比較:1)P<0.05；與模型+miR-NC組比較:2)P<0.05

2.3過表達miR-107-3p對AD細胞凋亡的影響 與對照組比較，模型組細胞凋亡率顯著升高；與模型+miR-NC組比較，模型+miR-107-3p組細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見表2，圖2。

圖2 細胞凋亡流式圖

2.4miR-107-3p靶向調控SLC25A38的表達 運用starbase數據庫預測miR-107-3p與SLC25A38的序列結合位點(圖3)；與miR-NC組比較，miR-107-3p組WT-SLC25A38細胞中熒光活性顯著降低，MUT-SLC25A38細胞中熒光活性不受影響(表3)，與模型+miR-NC組(0.39±0.04)比較，模型+miR-107-3p組，細胞中SLC25A38表達(0.18±0.03)顯著降低，與模型+anti-miR-NC組(0.37±0.03)比較，模型+anti-miR-107-3p組，細胞中SLC25A38表達(0.82±0.07)顯著升高(P<0.05)。見圖4。

圖3 SLC25A38的3′UTR中含有與miR-107-3p互補的核苷酸序列

表3 雙熒光素酶報告實驗

1～4：模型+miR-NC組,模型+miR-107-3p組,模型+anti-miR-NC組,模型+anti-miR-107-3p組圖4 各組SLC25A38蛋白表達

2.5抑制SLC25A38表達對AD細胞存活率和凋亡的影響 與模型+si-NC組比較，模型+si-SLC25A38組細胞中SLC25A38蛋白表達顯著降低，細胞存活率顯著升高，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見圖5、表4。

圖5 模型+si-NC組及模型+si-SLC25A38組SLC25A38蛋白表達

表4 抑制SLC25A38表達對AD細胞存活率和凋亡的影響

2.6SLC25A38過表達逆轉了miR-107-3p過表達對AD細胞存活率和凋亡率的作用 模型+miR-107-3p+pcDNA-SLC25A38組與模型組+miR-107-3p+pcDNA組比較，細胞中SLC25A38蛋白表達顯著升高，細胞存活率顯著降低，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。見圖6，表5。

1：模型+miR-107-3p+pcDNA組；2:模型miR-107-3p+pcDNA-SLC25A38組圖6 Western印跡檢測SLC25A38蛋白表達

表5 SLC25A38過表達逆轉了miR-107-3p過表達對AD細胞存活率和凋亡率的作用

3 討 論

隨著AD的患病率增加，尋找確定的，易于獲取的診斷生物標志物變得越來越重要。參與蛋白質合成的表觀遺傳調控的miRNA是一種生物標記，與許多疾病狀態地變化相關。與AD相關的miRNA有miR-107、miR-125b、miR-146a、miR-181c、miR-29b和miR-342，其中作用最顯著的為miR-107〔8〕。阮杰等〔9〕、段冉冉等〔10〕在研究中均報道，miR-107與神經退行性疾病的發生發展密切相關。Wang等〔11〕使用miRNA表達微陣列對肯塔基州AD中心腦庫中提取的人腦組織中提取的RNA進行了近乎最佳的臨床病理學相關性研究發現，在AD相關的miRNA表達變化中，miR-107是特殊的，因為即使在病理最早階段的患者中miR-107水平也顯著降低，與神經病理學交叉比較的原位雜交證明AD病理學涉及的特定大腦皮質層表現出神經元中miR-107表達減少，另外，計算分析預測β位點淀粉樣蛋白前體蛋白切割酶(BACE)1 mRNA的3′-UTR被miR-107靶向增殖，在miRNA微陣列上分析的相同RNA材料，使用Affymetrix外顯子陣列微陣列在非癡呆，輕度認知障礙(MCI)和AD患者上進行mRNA表達譜分析顯示，隨著miR-107水平在AD進展中降低，BACE1 mRNA水平趨于增加，用預測的miR-107結合位點的子集進行的細胞培養報道分子測定表明，在BACE1 mRNA的3′-UTR中存在至少1種生理miR-107 miRNA識別序列，表明miR-107可能通過調節BACE1參與加速疾病進展。王雪銀等〔12〕通過構建上調miR-107的AD大鼠發現，上調miR-107后大鼠腦組織中記憶相關蛋白NMDA受體2B和谷氨酸受體1的表達量均明顯的升高，空間依賴的學習記憶力得到明顯的改善。Hu等〔13〕研究發現，在Tg19959小鼠模型中miR-107低表達，而SYK高表達，熒光素酶測定證實了miR-107和SYK中的靶向關系，且核因子(NF)-κB信號通路在體外被激活，另外通過DAPI染色驗證抑制SYK或NF-κB信號通路可減少Tg19959小鼠神經細胞的凋亡，揭示了miR-107可通過抑制NF-κB信號通路和SYK改善空間記憶和抑制細胞凋亡。本研究是國內外首次發現miR-107-3p在AD中與SLC25A38的作用機制，為miR-107-3p用于AD的靶向治療提供更充分的理論依據。

研究證實，SLC25A38的表達水平在AD患者中明顯升高，并且在原代大鼠和小鼠神經元及人神經母細胞瘤細胞中β-淀粉樣蛋白42可上調SLC25A38水平增加胱天蛋白酶誘導的細胞凋亡，SLC25A38的小干擾RNA降低了β-淀粉樣蛋白42誘導的細胞凋亡，并且敲除SLC25A38在動物AD模型中可明顯改善神經損傷和認知能力〔14〕。Zheng等〔15〕發現，在人神經母細胞瘤細胞中SLC25A38過度表達可誘導細胞的凋亡，細胞內的血紅素表達水平升高，ROS過量產生，線粒體膜電位喪失。本研究發現，過表達SLC25A38可逆轉miR-107-3p對AD細胞存活率和凋亡率的作用。

綜上，miR-107-3p可促進AD細胞的存活，抑制凋亡，其機制可能與靶向SLC25A38有關，為AD的治療提供新方向。