硒多糖抗肝細胞癌效應與硫氧還蛋白1的關系

張寧 邱佳 張安龑 宮路路

(1遵義醫藥高等?？茖W校,貴州 遵義 563000；2遵義醫科大學第二附屬醫院)

肝細胞癌(HCC)是全球第五大最常見的惡性腫瘤〔1〕。流行病學數據顯示，全球每年新發HCC病例超過78萬，其中我國約占50%〔2〕。肝癌也成為第二大致死癌癥，5年生存率低于20%〔3，4〕，原因在于大多數患者在確診時已屬中后期或晚期。盡管臨床上有些藥物已被用來治療HCC，但是整體效果欠佳，易出現副作用〔5〕。靈芝是一種高效的抗肝癌中藥材，可增強人體免疫力，調節血糖，控制血壓，輔助腫瘤放化療，保肝護肝等作用，硒多糖是靈芝中的一種重要藥用成分，并在靈芝抗肝癌過程中扮演了十分重要的角色，但硒多糖的抗肝癌機制尚不清楚。

1 材料和方法

1.1實驗材料、器材和試劑 細胞操作間、液氮罐、高壓滅菌鍋、恒溫水浴鍋、玻璃平皿、移液器、細胞培養箱、倒置顯微鏡、96孔板、6孔板、低速離心機、EP管、干式變性儀，電泳、轉膜等相關設備，膠片；顯影液、定影液，十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)配制試劑，抗生素，低糖的DMEM培養基，胎牛血清，MTT試劑，二甲基亞砜(DMSO)，硒多糖，細胞凋亡相關蛋白抗體(CST)如Caspase-3、Caspase-9等。硫氧還蛋白(Trx)-1一抗、β-actin及二抗(Santa Cruz)。

1.2細胞、細胞培養及藥物濃度 本實驗所用人HCC細胞株HepG2購買于中國科學院昆明動物研究所。HepG2細胞用低糖的DMEM培養基在37℃含有5%CO2和95%濕度培養箱中培養，DMEM培養基含有10%熱滅活的胎牛血清和抗生素(100 IU/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素)。取對數生長期細胞用于實驗。當細胞生長密度在75%左右時加藥處理。用新鮮DMEM培養基配制不同濃度的實驗藥物溶液。濃度效應實驗藥物濃度設為0、50、100、200、400 μg/ml，作用時間24 h。

1.3MTT法檢測硒多糖對HepG2細胞活力的影響 將細胞于生長對數期消化，離心去掉培養基，然后加入新培養基使其懸浮混勻，并將懸浮均勻的HepG2細胞接種到96孔板中，細胞密度約1×104/ml，每孔100 μl，平行孔為6個為宜，然后每孔再加入不同濃度待測化合物完全培養基100 μl，并放置在培養箱里培養。培養24 h后，加入20 μl MTT溶液，繼續培養4 h。離心去上清，每孔加入150 μl的DMSO，置于水平搖床上震蕩使其充分溶解。使用酶標儀在570 nm條件下測定OD值，利用相應軟件計算細胞增殖抑制率。化合物濃度為0、50、100、200、400 μg/ml。

1.4Western印跡檢測硒多糖對HepG2細胞Trx-1及凋亡相關蛋白表達的影響 將藥物處理后的細胞收集離心，去上清，然后用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，再次離心去上清。加入細胞裂解液裂解。裂解充分后離心取上清，利用聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白定量試劑盒對待測樣品定量。然后根據目的蛋白的特性依次是制樣、電泳、轉膜、封膜、洗膜、標一抗、洗膜、標二抗、洗膜、孵育發光底物和曝光顯影。用Image J軟件對條帶進行分析。

1.5結果與分析 采用統計分析軟件GraphPad Prism6進行方差分析。

2 結 果

2.1硒多糖對HepG2細胞活力的影響 硒多糖能夠使HepG2細胞活力呈現濃度依賴下降的趨勢，相比于0 μg/ml組細胞活力(1.00±0.08)，50 μg/ml和100 μg/ml組(1.00±0.11和0.91±0.08)均無顯著變化(P>0.05)；200 μg/ml和400 μg/ml組細胞活力(0.78±0.04和0.65±0.05)均較其他濃度組出現顯著下降(P<0.05)。200 μg/ml、400 μg/ml硒多糖刺激時出現細胞活力較其他濃度顯著下降(P<0.05)。

2.2硒多糖對HepG2細胞Trx-1表達的影響 隨著硒多糖濃度增高，HepG2細胞內Trx-1表達量不斷降低，200、400 μg/ml硒多糖組Trx-1表達較其他濃度組顯著降低(P<0.01)，見圖1，表1。

2.3硒多糖對HepG2細胞凋亡相關蛋白表達的影響 隨著硒多糖濃度增高，Caspase-3、Caspase-9的表達量升高，Caspase-3在200 μl/ml時開始出現顯著變化(P<0.01)，Caspase-9在100 μl/ml時開始出現顯著變化(P<0.05)，見表1，圖2。

1～5:0、50、100、200、400 μg/ml硒多糖組，下圖同圖1 硒多糖對HepG2細胞內Trx-1表達的影響

表1 硒多糖對HepG2細胞內Trx-1、Caspase-3和Caspase-9表達的影響

與0 μg/ml組比較：1)P<0.01；2)P<0.05

圖2 硒多糖對HepG2細胞Caspase-3、Caspase-9表達的影響

3 討 論

HCC的發病率因地理區域而異，與各種危險因素有關，包括乙型肝炎和丙型肝炎病毒感染、肝硬化(炎癥和纖維化引起的慢性肝損傷)、酗酒、老年、男性、代謝綜合征和黃曲霉毒素B暴露等。盡管目前有些藥物如索菲拉尼在延長HCC患者生存期等方面有一定優勢，但因復發、轉移、副作用和耐藥性等原因，總體效果不太明顯〔6，7〕。因此，HCC的治療迫切需要更安全有效的新型藥物。

靈芝是我國一種具有悠久歷史的藥用真菌，是一種珍貴的滋補偏方。硒是機體生理活動必需的微量元素之一，在提高機體免疫力、抗氧化、抗腫瘤方面均發揮著重要作用〔8〕。硒多糖作為一種有機硒化合物，既保持了多糖較高的生物利用率又具有硒的生物功能，對生物體的毒性大大降低，且活性明顯高于硒和多糖〔9〕。硒多糖具有調節健康小鼠免疫功能的作用〔10〕。

Trx-1是一個在動物體內廣泛分布的氧化還原調節蛋白〔11〕，Trx-1在多種腫瘤組織中表達增高，與癌癥的關系密切，具有促進癌細胞的生長，抑制癌細胞凋亡作用〔12〕，因此，Trx-1已成為癌癥的治療的一個重要靶點，Trx-1調控的細胞凋亡也成為治療腫瘤細胞生長的一個潛在治療途經。細胞凋亡在正常情況下，在消除受損細胞以維持體內平衡方面發揮著重要作用。然而，凋亡信號通路的缺陷可以刺激腫瘤發生，促進癌細胞存活。因此，誘導腫瘤細胞凋亡是治療癌癥的方法之一。Bcl-2家族蛋白和Caspase級聯在細胞凋亡調控中發揮重要作用。Bcl-2家族分為抑制凋亡和促進凋亡蛋白兩大類，Bcl-2具有抑制細胞凋亡的作用，Bax是線粒體外膜的促凋亡蛋白；它促進凋亡分子的內在凋亡釋放〔13〕。在神經瘤細胞中用干擾Trx-1的表達，Bcl-2的表達量明顯下降并且線粒體膜電位改變，Caspase-3被激活，進而激活Caspase-9，促進癌細胞凋亡〔14，15〕。本實驗顯示Trx-1的表達量降低以后，凋亡相關蛋白Casepase-3、Caspase-9的表達量升高，也表明硒多糖可能是通過調節Trx-1的表達誘導HepG2細胞發生凋亡反應，從而抑制HepG2細胞的生長。