埃塞俄比亞發酵食品中乳酸菌的分離鑒定

郭艷榮，黨娜，蘇馨，劉文俊，孫天松

（內蒙古農業大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室，農業農村部奶制品加工重點實驗室，內蒙古自治區乳品生物技術與工程重點實驗室，呼和浩特010018）

0 引 言

埃塞俄比亞位于非洲東北部，是中東、非洲及亞洲的“十字路口”，以咖啡貿易著稱，有傳統手工咖啡制作和傳統發酵面食等食品加工技藝。同時，埃塞俄比亞也是非洲最大的蜂蜜生產國，其蜂蠟生產排名世界第四，有多達幾百萬蜂蜜集群和800 多種蜂蜜資源作物[1]。

蜂蜜酒是酒的一種，蜂蜜中加水稀釋，經過發酵生成酒精而制成[2]。蜂蜜中含有極高的糖分，極高的滲透壓使微生物難以繁殖，將蜂蜜以水稀釋后，糖分的濃度下降，微生物能夠在適宜的滲透壓下繁殖，開始發酵。蜂蜜酒被認為是人類釀造的第一種酒精飲料，約有1 萬年的歷史[3]。Mead 是埃塞俄比亞出產的著名蜂蜜酒。它是用當地的蜂蜜制成的，用煙、樹葉和 Gesho（Rhamnus Prinoides）的樹枝調味，給人一種酒花般的味道[4]。

面引子是傳統面食加工中的發酵劑，其中含有多種微生物，包括各類酵母菌及少量細菌，能引發多個生化反應，混合協同發酵產生復雜的風味物質，賦予面食更加細致的質地、細膩的口感和更為豐富的風味[5]。Teff是埃塞俄比亞地區由不同谷物制成的發酵食品，包括高粱，玉米，小麥，大麥等一些谷物的組合[6]。大多數埃塞俄比亞人對Teff 的喜愛程度超過了其他任何食品。它是一種稀薄的軟發酵烘焙食品，通常使用來自不同來源的天然發酵劑[7]，根據環境溫度進行24～96 h的發酵后獲得[8-9]。

埃塞俄比亞也是咖啡生長的天然產地，獨特的地理環境和氣候條件，使得這里的咖啡富有一種葡萄酒的香味，由此釀造的咖啡果酒也深受人們喜愛[10]。

這些傳統發酵食品和飲品，使用傳統技術經多種原材料制成，獨特的加工方式，加之飲食結構和地理位置等的差異，導致發酵產品中乳酸菌的多樣性，越來越受到研究人員的關注。而目前，咖啡，蜂蜜酒和面引子中關于酵母菌的報道較為常見[11-13]，而對其中的乳酸菌卻鮮有報道。本文采用實驗室純培養方法對埃塞俄比亞地區采集的4 份發酵食品中的乳酸菌進行分離純化，運用16S rRNA 基因序列分析方法對分離株進行鑒定，對埃塞俄比亞地區發酵食品中乳酸菌的多樣性進一步分析，以便了解該地區食品中乳酸菌的組成與種類，為豐富傳統發酵食品中乳酸菌資源提供菌種。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

本實驗所研究的樣品是由中國科學院微生物所研究員惠贈，研究人員于2019 年5 月，在埃塞俄比亞季馬，Sekoru 等地區采集，包括咖啡、蜂蜜酒、面引子等共計4 份樣品。將采集的樣品立即放置在低溫保存，及時帶回實驗室進行乳酸菌的分離純化等研究。

表1 埃塞俄比亞地區采集樣品信息

1.2 培養基與試劑

培養基：MRS 固體培養基和MRS 液體培養基，M17 固體培養基和 M17 液體培養基。MRS、M17 培養基均購自英國Oxoid 公司。

試劑：脫脂乳保護劑，提取DNA 所用試劑，PCR擴增和電泳檢測所用試劑。細菌基因組DNA 提取試劑盒，天根生物技術（北京）有限公司。

1.3 儀器與設備

pH 計（FE20），梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；全自動高壓干熱滅菌器（ADVANTEC SP-650），日本ALP 公司；恒溫培養箱（LRH-500F），上海一恒科技有限公司；光學顯微鏡（BX50），日本OLYMPUS公司；電熱恒溫水浴鍋（HWS28），上海一恒科技公司；梯度基因擴增儀（MJRESEARCH PTC-200），伯樂公司；電泳儀（DYY-12），北京六一生物科技有限公司；凝膠成像分析系統（UVPGDS-8000），UVP 公司；微量紫外分光光度計（ND-1000），Nanodrop公司。

1.4 乳酸菌的計數

乳酸菌計數根據參考文獻[13]采用MRS 和M17 培養基法菌落計數法，將樣品用PBS 緩沖液進行梯度稀釋，然后用傾注法進行計數，37 ℃培養48 h 進行菌落計數，所有樣品進行3次重復。

1.5 乳酸菌的分離純化及保存

蜂蜜酒，咖啡等液體樣品中乳酸菌計數方法參考劉紅新等人對哈薩克斯坦傳統發酵乳制品中乳酸菌多樣性的研究，采用涂布培養法[14]。

面引子樣品需要先在脫脂乳培養基中進行增菌培養12 h，然后取發酵凝乳的培養基0.5 mL 進行10 倍梯度稀釋，傾注培養。厭氧培養48 h 后，菌落形成進行計數，并計算樣品活菌數。

采用涂布法對樣品進行稀釋涂布，37 ℃培養48后，獲得樣品中的不同菌落，觀察并記錄菌落形態（顏色、形狀、大小、邊緣等），挑取特征菌落，于對應的固體培養基上劃線2～3 次，直至獲得純培養物。經革蘭氏染色，過氧化氫酶觸試驗，將疑似乳酸菌的純培養物進行保藏，以待后續試驗。

1.6 總DNA 的提取及純度的檢測

將乳酸菌二代純培養液（2 mL），8 000 r/min 離心1 min，棄上清液，收集離心到的菌體。采用細菌基因組DNA 提取試劑盒提取乳酸菌DNA，并用ND-1000型微量紫外分光光度計對DNA 濃度和純度進行檢測并記錄。

1.7 16S rRNA 基因的 PCR 擴增

將濃度偏大的DNA 稀釋到100 ng/μL 左右，配制PCR 反應體系，利用梯度基因擴增儀進行16S rRNA擴增和測序。PCR 擴增反應，以提取菌株的基因組DNA 的稀釋液為模板，引物為27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和 1495R（5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'）[15]。PCR 反應體系（50 μL）及擴增程序如表2所示。

表2 PCR反應體系（50 μL）及擴增程序

擴增完畢后，將PCR 擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，若在1 500 bp 處有清晰明亮的擴增條帶，且無拖尾、彌散現象，則PCR 擴增成功[16]。將PCR 擴增產物送往上海美吉生物公司進行純化和DNA 測序。

1.8 同源性分析

將測序得到的 DNA 序列運用 SeqMan（DNAStar5.01）軟件進行序列拼接后，通過Blast 程序（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）與 Gen Bank數據庫中的已知細菌的核酸序列進行同源性比對分析，以同源性大于99%為種的分界閾值，將待鑒定菌株與對應模式菌種的16S rRNA 基因序列用MEGA 6.0建立系統發育樹，進行系統發育關系研究。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的計數結果

表3 埃塞俄比亞地區采集樣品乳酸菌活菌計數結果

由表3 可知，本次采集樣品中兩份面引子樣品的活菌數相對較高，而蜂蜜酒和咖啡樣品中含乳酸菌較少。

2.2 乳酸菌的鑒定

2.2.1 乳酸菌分離株的菌落形態及表型特征

根據乳酸菌的形態學特征[17-18]，初步從4 份樣品中共分離出55 株疑似乳酸菌的菌株。在MRS 和M17 固體培養基上菌株的菌落呈圓形，中等大小，凸起，乳白色，濕潤，邊緣整齊，有些菌落表面光滑，有些粗糙。經過革蘭氏染色、過氧化氫酶反應，均為革蘭氏陽性，過氧化氫陰性菌。初步將55 株菌定為乳酸菌。

2.2.2 菌種DNA 提取和16S rRNA 擴增結果

DNA 濃度和 OD260/280的測定：OD260/280值在 1.8～2.0 間即為純DNA 樣品。將其質量濃度稀釋至100 ng/μL 后對乳酸菌分離株16S rRNA 基因進行擴增。經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，可以觀察到在大約1 500 bp 的位置處有一條清晰明亮的條帶，并且無彌散現象，無明顯非特異擴增現象。

圖1 部分菌株的16S rDNA PCR擴增產物電泳結果

2.2.3 系統發育樹的構建和乳酸菌鑒定結果

將測序獲得的16S rRNA 基因序列通過NCBI 數據庫中BLAST 進行同源序列比對分析，以與模式菌株序列同源性大于99%為種的鑒定閾值，將55 株分離株鑒定為乳酸菌的3個屬，11個種。

圖2 部分菌株的系統發育樹

由圖2可以看出，IMAU97880與模式菌株Lactobacillus crustorum（AM285450）聚為一類，且同源性為100%，故將其鑒定為Lactobacillus crustorum。菌株IMAU97863與 模 式 菌 株Lactobacillus plantarumATCC14917（AJ965482）聚為一類，且同源性為100%，因此可將其鑒定為Lactobacillus plantarum。菌株IMAU97879 與模式菌株Lactobacillus zymae（AJ632154）聚為一類，且同源性為 100%，故將其歸為Lactobacillus zymae。菌株IMAU97858 與模式菌株Streptococcus thermophilusATCC 19258 聚為一類，且同源性為100%，因此可將其歸為Streptococcus thermophilus。菌株IMAU97894 與模式菌株Enterococcus faeciumATCC19434（AJ301830）聚為一類，同源性為100%，將其鑒定為Enterococcus faecium。菌株IMAU97893與模式菌株Lactobacillus harbinensis（AB196123）聚為一類，且同源性高達100%，因此可將其歸為Lactobacillus harbinensis。菌株菌株IMAU97889與模式菌株Lactobacillus paracaseiATCC25302（D79212）聚為一類，且同源性達到100%，因此鑒定為Lactobacillus paracasei。菌株IMAU97862與模式菌株Lactobacillus helveticus（AM113779）聚為一類，同源性達到100%，故將其歸為Lactobacillus helveticus。IMAU97905 與模式菌株Lactobacillus reuteriATCC23272（L23507）聚為一類，且同源性高達100%，故將其鑒定為Lactobacillus reuteri。菌株IMAU97852與模式菌株Lactobacillus pontisATCC51518（X76329）聚為一類，同源性為98%，故將其歸為Lactobacillus pontis。IMAU97868 與模式菌株Lactobacillus panis（X94230）聚為一類，且同源性為100%，故將其鑒定為Lactobacillus panis。

2.3 優勢菌種分析

乳酸菌的分布結果如表4所示。

埃塞俄比亞地區發酵食品中乳酸菌的分離結果見表4。由表4 可知，4 份發酵食品中分離出的55 株乳酸菌疑似株，經16S rDNA 序列測定和同源性分析鑒定，分屬于3 個屬11 個種或亞種，Lactobacillus pontis為埃塞俄比亞地區發酵食品中的優勢菌種，占總分離株的32%。其中ASE1 蜂蜜酒樣品共分離出16 株乳酸菌，Lactobacillus paracasei為優勢菌種，占 ASE1 樣品總分離數的75%。ASE2 咖啡果酒樣品僅分離出2 株乳酸菌，均為Lactobacillus reuteri。ASE3、ASE4 兩份面引子樣品共分離出37 株乳酸菌，均含有Lactobacillus pontis和Lactobacillus helveticus，但優勢菌種不同，ASE3 樣品的優勢菌種為Lactobacillus pontis，占ASE3 樣品總分離數的78%，而ASE4 樣品的優勢菌種為Lactobacillus zymae，占ASE4樣品總分離數的55%。

表4 埃塞俄比亞地區發酵食品中乳酸菌的分離結果

如表5 所示，為不同研究人員對3 種發酵食品中乳酸菌的分離鑒定結果對比，我們發現，不同地區蜂蜜酒中所含的微生物不同，Bulgasem 等人對馬來西亞等地區中蜂蜜的分離鑒定表明蜂蜜中重要含有乳桿菌屬和片球菌屬乳酸菌[19]，Snowdon 等人的研究則在蜂蜜中發現了芽孢桿菌，腸球菌和產黃菌屬（Flavobacterium）乳酸菌[20]，而我們從埃塞俄比亞地區蜂蜜酒中分離到了乳桿菌屬及腸球菌屬乳酸菌?？Х戎腥樗峋鄬^少，Bruyne 等人從咖啡中分離到1 株Leuconostoc holzapfeliisp. nov[21]，本研究中也僅分離到2 株羅伊氏乳桿菌。我們也對比了同為埃塞俄比亞地區的面引子中乳酸菌的分離情況，發現GASHE 等人分離的TEF 面引子樣品中優勢菌株為乳桿菌屬[22]，Tilahun等人的分離鑒定結果則表明腸球菌屬是優勢菌株[23]，而我們對2 份面引子的研究結果也表明乳桿菌屬是優勢菌株。

表5 不同地區3種傳統發酵食品中乳酸菌的菌群結果比較

3 結 論

從埃塞俄比亞地區采集的4份傳統發酵食品樣品中乳酸菌活菌數為 1.7×101～1.25×104CFU/mL，乳酸菌含量均較低。4份乳樣品中共分出55株菌，經鑒定分別歸屬 于Lactobacillus pontis、Lactobacillus paracasei、Lactobacillus zymae、Lactobacillus reuteri、Lactobacillus panis、Enterococcus faecium、Lactobacillus helveticus、Lactobacillus harbinensis、Streptococcus thermophilus、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus crustorum11 個種或亞種。其中Lactobacillus paracasei為埃塞俄比亞地區蜂蜜酒中的優勢菌株，占該樣品總分離株的75%，Lactobacillus pontis為該地區面引子中的優勢菌種，占該樣品總分離株的41%。