牡蠣肽酸奶工藝及體外抗氧化活性研究

戴梓茹，吳遠清，張晨曉，梁東萍，覃柳英

（1.廣西高校北部灣特色海產品資源開發與高值化利用重點實驗室，廣西欽州535011；2.北部灣大學食品工程學院，廣西欽州535011）

0 引 言

牡蠣是北部灣重要的海產資源，它肉質鮮美爽滑、營養豐富，有“海洋牛奶”的美稱。牡蠣中的必需氨基酸完全程度和質量比例優于牛乳和人乳[1]。益生菌不僅在人體腸道內起著營養、激活免疫及抗感染、能減少食物過敏[2]，抗高血壓[3]，而且還具有抗過敏[4]、抗腫瘤[5]、抑制致病菌[6]，防治消化性潰瘍和改善酒精性脂肪肝等多種益生效果[7]。牡蠣多肽具有一系列生物功能，盧學敏等[8]研究發現牡蠣中含有一些活性肽對副溶血性弧菌、枯草芽孢桿菌等具有一定的抑制作用。Lee 等[9]酶解太平洋牡蠣并得到兩個具有HIV-1蛋白酶抑制活性的六肽。同時，牡蠣肽具有良好的抗氧化性，是一種天然的抗氧化劑，并含有重要的抗癌藥物的組分[10]；牡蠣肽還具有增強小鼠免疫力、游泳耐受力等良好的保健效果[11-12]。

廣西北部灣牡蠣資源豐富，但本地缺乏牡蠣深加工企業以及相關加工技術，使得北部灣處于整個牡蠣產業鏈的原料端，產業產品的附加值低，致使產業技術升級艱難，因此，促進牡蠣和牡蠣產品多樣化開發，提高產業效益迫在眉睫。本文采用響應曲面法優化牡蠣多肽酸奶制備工藝，研制出的酸奶產品酸甜適中，口感較好，為牡蠣的高值化開發利用提供了可靠的技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牡蠣肽粉，北部灣大學食品工程學院實驗室制備保存；德氏乳桿菌德氏亞種-保加利亞菌、嗜熱鏈球菌種、副干酪乳桿菌種均為中國科學微生物研究所保藏；全脂奶粉，紐瑞滋上海食品有限公司；脫脂奶粉，恒天然商貿上海有限公司；精制白砂糖，柳州市柳冰食品廠；海藻酸鈉，思遠生物科技；活性炭粉末狀食品級，海星供水網上店；一水檸檬酸食品級，湖北鑫潤德化工有限公司；0233 培養基，006 培養基，CGMCC 建議培養基；MRS 培養基，BR 培養基：北京陸橋技術有限責任公司；NaCl，天津市鼎盛鑫化工有限公司；NaOH，HCl，國藥集團化學試劑有限公司；酚酞，天津市恒興化學試劑制造有限公司；酒精，新泰市潤生醫療衛生用品有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 工藝流程圖

1.2.2 脫腥處理

采用了葉盛權[13]等人的方法，用0.5%活性炭量，調節pH 等于7.0、在恒溫水浴鍋30 ℃條件下吸附保溫0.5 h，過濾，濾液待用。

1.2.3 菌種的恢復培養

（1）恢復培養：移取4 mL 液體培養基至安瓿瓶內，輕震，使凍干菌粉形成懸浮液，移取2 mL 懸浮液于10 mL 的培養基管中，置于37 ℃培養下培養至培養液出現渾濁或有沉淀狀態，培養時間為20～43 h。

（2）擴大培養：將恢復培養的菌種進行擴大培養，培養時間為12～36 h。

（3）凝乳實驗：配置濃度為10%的牛奶培養基，接種量為1.5%，培養至凝乳，牛奶凝固后，即為需要的發酵益生菌母菌種。

1.2.4 牡蠣肽酸奶制備工藝優化

1.2.4.1 單因素實驗

以牡蠣多肽酸奶的感官評分為評價指標，考察菌種（菌種保加利亞菌、嗜熱鏈球菌、副干酪乳桿菌）、菌種比例、菌種接種量、牡蠣肽添加量、白砂糖添加量、增稠劑（海藻酸鈉）添加量、發酵時間、奶粉添加量對產品感官品質的影響。

1.2.4.2 響應曲面設計優化酸奶配方

根據單因素試驗結果，選取影響較大的4 個因素進行響應面設計。即選用牡蠣肽添加量、菌種接種量、白砂糖添加量、發酵時間作為影響因素，以感官評價為指標，利用design-expert8.0.6trial 軟件，利用Box-Behnken 設計原理設計響應面優化方案。響應面試驗因素水平如表1 所示，感官評分標準如表2 所示。

表2 感官評分標準

1.2.5 理化指標及微生物指標測定

根據GB/T4789.35-2016測定乳酸菌[14]。

根據GB 4789.2-2016測定菌落總數[15]。

根據NaOH 滴定法測定酸度。

根據過量水方法測定持水力。

pH 計測量 pH 值。

1.2.6 牡蠣肽酸奶抗氧化活性測定

1.2.6.1 樣液制備

參考文獻[16-17]并根據實際對實驗方法進行修改，稱取發酵8 h 后的酸奶5.0 g，以40%甲醇為提取液，超聲1 h 后過45 μm 有機膜，即可提取出酸奶中的抗氧化活性物質，備用。

1.2.6.2 還原力測定

采用鐵氰化鉀法檢測還原力，取按1.2.6.1 所制備的提取物1.0 mL，先后向其中加入pH 6.6 2.5 mL 的磷酸鹽緩沖液，2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液，混勻，置于50 ℃水浴20 min，加入2.5 mL10% TCA 以及0.5 mL0.1%氯化鐵，混勻靜置10 min，于700 nm 測吸光值，以超純水為空白，吸光值越高，表明抗氧化效果越好。

1.2.6.3 DPPH 清除率測定

取按1.2.6.1 所制備的提取物5.0 mL，向其中加入5.0 mL 0.1 mmol/L DPPH 乙醇溶液，避光室溫反應30 min，于 517 nm 處測其吸光值為 As，Ao 為 5.0 mL 蒸餾水與5.0 mL 0.1 mmol/L DPPH 乙醇溶液混合物于517 nm 處所測吸光值，Ac 為按1.2.6.1 所制備的提取物5.0 mL 與5.0 mL 乙醇混合后于517 nm 處所測吸光值，計算公式為：

2 結果與分析

2.1 單因素對牡蠣肽酸奶感官評分的影響

選擇菌種種類、菌種配比、菌種接種量、牡蠣肽添加量、白砂糖添加量及發酵時間作為單因素，考察其對牡蠣肽酸奶感官評分的影響，結果如圖1 所示。結合3 種菌種對牡蠣多肽酸奶感官評分，考慮酸奶的較適宜的pH 范圍（4.0～5.0）[18]，選擇嗜熱鏈球菌、保加利亞菌進行聯合發酵（圖1a）。嗜熱鏈球菌：保加利亞菌種比例為3∶1 時，感官評分最高，此時產品pH 為4.50，牡蠣肽酸奶酸甜可口，組織狀態較好（圖1b）。菌種接種量為3.0% 時，感官評分最高，為82.6 分，此時，牡蠣肽酸奶的pH 穩定，酸甜可口，口感細膩，無異味（圖1c）。當牡蠣肽添加量為0.3 g/100 mL 時，感官評分最高，pH 為4.67，具有牡蠣產品特有的香味，風味物質形成良好，酸甜適中，口感細膩，無異味（圖1d）。白砂糖添加量為7.0% 時，感官評分最高，pH 為4.71，產品無酸澀甜膩感（圖1e）。當發酵時間為7.0 h 時，感官評分最高，pH 為4.45，酸奶組織狀態好，口感酸甜可口。因此，選擇發酵時間為7.0 h（圖1f）。綜上，選擇嗜熱鏈球菌、保加利亞菌進行聯合發酵，各因素的最適量分別為菌種配比3∶1、菌種接種量3.0%、牡蠣肽添加量0.3 g/100 mL、白砂糖添加量7.0%、發酵時間7 h。

圖1 單因素對牡蠣肽酸奶感官評分的影響

2.2. 響應面試驗結果及分析

2.2.1 響應面試驗評分結果

以牡蠣肽添加量、菌種接種量、白砂糖添加量、發酵時間作為影響因素，以感官評分為指標，利用design-expert8.0.6 trial 軟件設計的響應面優化進行試驗，得出感官評分如表3所示。

采用design-expert8.0.6trial 軟件進行響應面分析后，可得以下方程模型：

Y=83.64-0.47A+0.29B-0.21C+1.44D+(2.5×10-3)AB-1.46AC+(2.5×10-3)AD+0.000BC+0.047BD-(2.5×10-3)CD-1.60A2-0.34B2-1.22C2-0.37D2

由表4 可以看出，依據P值的大小可以知道顯著性的差異，P值越小顯著性越高，模型P＜0.0001 表明該模型極其顯著。失擬項P=0.54045＞F=0.05，表示方程模擬的失擬項不顯著，方程擬合程度較高，實驗可信。P值＜F值時，該項具有顯著的影響，其中AB，AD，BC，BD，CD 項P＞0.05，說明這四項為不顯著項，表明了A 與B，A 與D，B 與C，B 與D，C 與D 之間的交互作用不明顯，AC 項P＜0.05，表明AC 之間具有顯著交互作用，依據P值可以知道，各因素對感官評分的影響順序為是：C＞B＞A＞D。

2.2.2 響應曲面分析

表3 響應面試驗感官評分結果

利用Design-Expert 8.0.6 軟件分析得出等高線圖以及響應曲面圖，同一個區域表示響應值一致，等高線形成橢圓越密集，以及響應曲面圖彎曲度越高，皆可表明因素間交互作用越顯著。圖2-圖7 是各因素間交互作用的等高線圖和響應曲面圖。

由圖2 等高線形成橢圓的密集程度以及響應曲面圖的彎曲程度可知，菌種接種量與發酵時間交互影響不顯著。菌種接種量在2.5%～3.0%，發酵時間在6.5～7.0 h時，感官評分最高。

圖2 菌種接種量和發酵時間的交互作用對牡蠣肽酸奶感官評分影響的響應曲面圖

表4 方差分析

圖3 菌種接種量和白砂糖添加量的交互作用對牡蠣肽酸奶感官評分影響的響應曲面圖

由圖3 等高線圖形成橢圓的密集程度以及響應曲面圖的陡峭程度可知，菌種接種量與白砂糖添加量交互影響顯著。菌種接種量為2.5%～3.0%，白砂糖添加量為6.5%～7%時，感官評分最高。

圖4 菌種接種量和牡蠣肽添加量的交互作用對牡蠣肽酸奶感官評分影響的響應曲面圖

由圖4 等高線圖形成橢圓的密集程度以及響應曲面圖的陡峭程度可知，菌種接種量與牡蠣肽添加量交互影響不顯著。菌種接種量為2.5%～3.0%，牡蠣肽添加量為0.3%～0.35% 時，感官評分最高。

圖5 發酵時間和白砂糖添加量的交互作用對牡蠣肽酸奶感官評分影響的響應曲面圖

由圖5 等高線圖形成橢圓的密集程度以及響應曲面圖的陡峭程度可知，發酵時間與白砂糖添加量交互影響不顯著。發酵時間為7%～7.5%，白砂糖添加量為7%～7.5% 時，感官評分最高。

圖6 發酵時間和牡蠣肽添加量的交互作用對牡蠣肽酸奶感官評分影響的響應曲面圖

由圖6 等高線圖形成橢圓的密集程度以及響應曲面圖的陡峭程度可知，發酵時間與牡蠣肽添加量交互影響不顯著。發酵時間為6.5%～7%，牡蠣肽添加量為0.25%～3%時，感官評分最高。

圖7 白砂糖添加量和牡蠣肽添加量的交互作用對牡蠣肽酸奶感官評分影響的響應曲面圖

由圖7 等高線圖形成橢圓的密集程度以及響應曲面圖的陡峭程度可知，白砂糖添加量與牡蠣肽添加量交互影響不顯著。白砂糖添加量為7%～7.5%，牡蠣肽添加量為0.25%～0.3%時，感官評分最高。

響應曲面圖呈上凸形態，表明回歸模型存在最大值，利用Design-Expert8.0.6 軟件在牡蠣酸奶基礎配方上進行優化，可得菌種接種量、發酵時間、白砂糖添加量、牡蠣肽添加量四個考察因素的最佳值分別為3.47%、8 h、7.69%、0.37 g/100mL，感官評分預期值為81.432，同時進行驗證實驗，實際感官評分為83.9，高于預測值，由此說明配方優化是可靠有效的。

2.3理化指標和微生物指標測定結果

表5 牡蠣多肽酸奶理化指標及微生物指標

由表5 可知，試驗結果符合國家相關標準，pH 值4.02在特定范圍內，持水力70%。

2.4 牡蠣多肽酸奶抗氧化能力研究

總還原力的檢測原理[19]主要是依據Fe3+-Fe2+之間的相互轉化，從而證明樣品是否具有抗氧化性。DPPH 清除自由基作用機理主要是通過加入抗氧化劑前后吸光值的變化計算出自由基清除率[20]。通過調查發現，發酵乳酸菌中會產生某種具有清除自由基能力的微生物[21-22]，牡蠣多肽中也含有能清除自由基的活性物質，故而兩者的復合使用，將會產生增效作用，使得產品的抗氧化活性增強。本研究通過測定總還原力和DPPH 自由基清除率探討牡蠣多肽酸奶的抗氧化能力，結果如圖8 和圖9 所示。隨著樣品濃度的逐漸增加，牡蠣多肽酸奶吸光值逐漸上升，當濃度為50 mg/mL 時可達0.257；酸奶對照則在樣品濃度為45 mg/mL 達到最高值 0.186，當濃度為 50 mg/mL 時，吸光值開始下降；將牡蠣酸奶與酸奶對照的DPPH 自由基清除率相比較，牡蠣酸奶的清除率高于酸奶對照，牡蠣酸奶的清除率可高達25.90%，酸奶對照為18.93%，從而可知牡蠣酸奶具有一定的抗氧化活性,在一定程度上提高了牡蠣肽酸奶的附加值。

圖8 總還原力

圖9 DPPH清除率

3 結 論

以感官評分為考核指標，采用單因素和響應曲面設計優化牡蠣酸奶工藝，并對產品理化指標、微生物指標及抗氧化指標進行分析。結果表明，牡蠣酸奶最優配方為菌種添加量3.47%，發酵時間8 h，糖添加量7.69%，牡蠣添加量0.37 g/100 mL，在此工藝下感官評分最高，

為83.90 分；制成牡蠣酸奶的乳酸菌總數為1.7×107cfu/mL，pH 值為4.02，滴定酸度為113 °T，持水力為70%，符合國家相關標準要求；牡蠣肽酸奶總還原力為0.257，DPPH 自由基清除率為25.90%，抗氧化能力顯著高于對照組，說明牡蠣肽酸奶有效提高了酸奶的抗氧化能力。該工藝下的產品呈乳白色，色澤均勻，有光澤，香味協調，有發酵乳固有香味，組織細膩均勻無氣泡，有酸牛奶固有滋味，酸甜可口。此牡蠣酸奶配方能較好滿足感官和生產所需，同時為牡蠣的深加工利用提供更好的參考依據。