38種中草藥對大菱鲆源副溶血弧菌的抑殺效果

任 海，華智杰，魏云卓，王 宇，靳曉敏

(河北科技師范學院動物科技學院，河北 秦皇島，066600)

弧菌病(Vibriosis)是世界各國海水養殖魚、蝦、蟹、貝類等水產動物危害最大的疾病，常給水產養殖業帶來巨大的打擊[1]。弧菌(Vibrio)是海洋環境中最常見一類條件致病菌，是水產業發展的主要限制因素之一。目前，國內外已經報道的弧菌病病原主要有鰻弧菌(V.anguillarum)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、哈維氏弧菌(V.harveyi)、擬態弧菌(V.mimicus)和創傷弧菌(V.vulnificus)等[2]。其中，副溶血弧菌為革蘭氏陰性桿菌，有鞭毛，無莢膜及芽孢，廣泛存在于養殖水域中，是海洋動物主要條件致病菌之一[3]，能夠引起包括魚、蝦、蟹、貝等多種海水養殖動物發病，給水產業造成巨大的經濟損失[4]。另外，該菌屬于人畜共患病原菌，能夠通過食源污染影響人類健康，常引起人體患急性腸胃炎并會伴有腹瀉、嘔吐、腹部痙攣等癥狀，嚴重者能夠導致人體死亡[5]。近年來，已有相關文獻報道副溶血弧菌可以侵染大黃魚[6]、三斑鲹[5]、半滑舌鰨[7]、凡納濱對蝦[8]和九孔鮑[9]等多種水產動物。

目前對水產動物細菌性疾病防治方面，以使用化學合成藥物和抗生素類藥物為主。隨著抗生素的頻繁使用，許多細菌已經產生了耐藥性問題，而且產生多重耐藥菌株，細菌耐藥性不斷增強，致使臨床感染死亡率不斷增高[10,11]。在長期的使用過程中，人們逐漸認識到這些藥物的不足之處，如預防作用弱，易產生耐藥性，抗菌譜窄，污染水環境等[1]。我國中草藥種類繁多，大部分價格低廉、來源方便、無毒副作用或者毒副作用低且不易產生耐藥性，還具有提高水產動物免疫力，提高其抗應激能力等多重功效[12]。研究顯示，很多具有清熱、抗炎和解毒的中草藥均具有抗菌作用[13]。王玉娥等[14]測定了10種常用中草藥對5種海洋致病弧菌的抑菌情況，結果發現，五倍子和黃連可作為防治水產動物弧菌病的首選藥物；王洪彬等[15]報道16種常用中草藥對4種水產動物致病菌體外抑菌效果的研究中發現，蘇木、女貞子、夏枯草、青皮均具有很好的抑菌作用。鄭天倫等[16]研究了15種中草藥對大黃魚源溶藻弧菌的體外抑菌試驗，結果發現石榴皮、地榆、五味子和大黃的抑菌能力最強。目前，副溶血弧菌對大菱鲆的危害已有相關報道[17]，但是對于中草藥對大菱鲆源副溶血弧菌抑殺效果未見相關報道。為此，筆者針對副溶血弧菌選擇了38種中草藥，確定其抗菌作用，以期為大菱鲆養殖過程中防治副溶血弧菌病的臨床用藥提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

試驗菌株來源于河北科技師范學院水產養殖實驗室，分離于秦皇島某養殖場患病大菱鲆，并經過形態特征、理化特點、致病性以及分子生物學鑒定證實為致病性副溶血弧菌。

1.2 中草藥及其來源

選擇的38種中草藥為：大黃、郁金、柴胡、五倍子、車前子、紫錐菊、蘇木、當歸、梔子、青蒿、魚腥草、黃芩、虎杖、貫眾、苦參、淫羊藿、黃連、黃芪、黃柏、大青葉、連翹、白頭翁、烏梅、穿心蓮、地錦草、益母草、何首烏、甘草、地榆、秦皮、石榴皮、丁香、地丁、女貞子、川棘子、赤芍、茵陳、訶子，均購自河北省昌黎縣百草堂藥店。

1.3 主要試劑

營養瓊脂，營養肉湯，96孔酶標板均購自北京康為世紀生物科技有限公司，其他試劑均由水產養殖實驗室提供。

1.4 主要儀器

電子天平CP224C，奧豪斯儀器有限公司生產；超凈工作臺ZRJH-C1112B，上海智城分析儀器制造有限公司生產；全溫振蕩培養箱BSD-100，電熱恒溫培養箱HPX-9082MBE，電熱鼓風干燥箱GZX-9076MBE，均為上海博迅醫療生物股份有限公司生產；高壓蒸汽滅菌器MLS-3751L-PC，日本Panasonic公司生產。

1.5 試驗方法

1.5.1中草藥藥液的制備 將上述38種中草藥分別稱取10 g放到400mL燒杯中，用蒸餾水浸泡3 h后用大火煮至沸騰，文火煎1 h，第一次煎煮藥物時需要加入400 mL蒸餾水，然后再用6層紗布過濾，過濾后的藥渣中再加入200 mL的蒸餾水用文火煮大約1 h，消毒紗布過濾后，將兩次所得藥液定容至50 mL，制成200 g/L[10,11]的中草藥原藥液，裝瓶、高壓滅菌后置于冰箱4 ℃備用。

1.5.2牛津杯打孔培養基的制作 將固體培養基從高壓蒸汽滅菌器內拿出，放到超凈工作臺內，待冷卻到大約60 ℃，搖勻后倒入到玻璃平板一層，使液體培養基均勻覆蓋玻璃平板底部即可，待冷卻凝固后小心放入牛津杯，每個玻璃平板均勻放置5個牛津杯，然后再緩緩倒入第二層培養基，厚度大約為整個平板的2/3即可，待培養基冷卻凝固后小心取出牛津杯，將平板置于冰箱4 ℃備用。

1.5.3菌種的活化 將副溶血弧菌置于普通營養瓊脂培養基上，28 ℃培養24 h，整個過程在超凈工作臺中進行操作。

1.5.4試驗菌液的制備 取出活化好的副溶血弧菌平板，用接種環在無菌條件下挑取菌落，將菌落溶解到1 mL無菌生理鹽水中制成菌懸液，參照麥氏比濁管使其濃度達到1×1011cfu/L。

1.5.5抑菌效果判定 采用牛津杯打孔培養基進行體外抑菌試驗測定，每種中草藥重復測定3次，取其平均值作為最終抑菌直徑。具體為：首先把菌液用滅菌棉簽均勻涂布于打孔培養基上，然后將中草藥藥液分別加入到每個孔內，以加滿而不溢出孔外為宜，置于28 ℃恒溫培養箱中培養24 h，測定抑菌圈直徑。判定標準以抑菌圈直徑≥20 mm判定為高度敏感(HS)，在10～19 mm判定為敏感(S)，<10 mm判定為耐藥(R)。

1.5.6最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)的測定 采用菌液涂布法和改良微量二倍稀釋法測定最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)，具體操作參考任海等[12]和張月娥等[14]的方法。

2 結果與分析

2.1 38種中草藥對副溶血弧菌的抑菌作用

副溶血弧菌對38種中草藥敏感程度的試驗結果表明：大菱鲆源副溶血弧菌對訶子、秦皮、石榴皮、黃連、黃芩、五倍子高度敏感，其抑菌圈直徑為20～27 mm(表1)，其中五倍子的抑菌作用最強，抑菌圈直徑為27 mm；其次為石榴皮和黃連，抑菌圈直徑為25 mm；對淫羊藿、青蒿、丁香、地榆、梔子、連翹、蘇木、烏梅、赤芍、地錦草、女貞子、黃柏、虎杖、白頭翁、川棘子敏感，其抑菌圈直徑為11～19 mm；對益母草、貫眾、甘草、大黃、大青葉、茵陳、郁金、當歸、黃芪、柴胡、何首烏和穿心蓮不敏感。

表1 38種中草藥對副溶血弧菌的抑菌作用 mm

注：敏感性判定標準以抑菌圈直徑≥20 mm判定為高度敏感(HS)；抑菌圈直徑10～19 mm判定為敏感(S)；抑菌圈直徑<10 mm的判定為耐藥(R)；無抑菌圈形成記作0。

2.2 21種對副溶血弧菌有抑菌作用的中草藥對副溶血弧菌的MIC

由表1結果中選取具有抑菌作用的21種中草藥進行副溶血弧菌的MIC測定。結果表明：21種中草藥對副溶血弧菌有不同程度的抑菌作用(表2)。其中抑菌效果最好的為五倍子、秦皮、黃連、黃芩、訶子和石榴皮，對副溶血弧菌抑菌效價均達到1∶128，即MIC為1.56 g/L；其次為淫羊藿、丁香、地榆、梔子、連翹、地錦草、蘇木、赤芍、烏梅和青蒿，抑菌效價為1∶64，即MIC為3.13 g/L；女貞子、黃柏、虎杖和川棘子的抑菌效價為1∶16，即MIC為12.50 g/L；白頭翁抑菌效價最低，為1∶8，即MIC為25.00 g/L。

2.3 21種對副溶血弧菌有抑菌作用的中草藥對副溶血弧菌的MBC

由表1結果中選取具有抑菌作用的21種中草藥進行副溶血弧菌的MBC測定。結果表明：21種中草藥對副溶血弧菌有不同程度的殺菌效果(表3)。其中以秦皮、五倍子、黃連、石榴皮、訶子、黃芩的殺菌效果最好，對副溶血弧菌的殺菌效價均達到了1∶64，即MBC為3.13 g/L；其次為淫羊藿、青蒿、丁香、地榆、梔子、連翹、地錦草、蘇木、烏梅和赤芍，殺菌效價均達到1∶32，即MBC為6.25 g/L；女貞子、黃柏、虎杖和川棘子的殺菌效價均達到1∶8，即MBC為25.00 g/L；白頭翁殺菌效價最低，為1∶4，即MBC為50.00 g/L。

3 討 論

近年來，中草藥被廣泛用于水產動物細菌性疾病的防治中。有關中草藥防治不同水產動物來源的副溶血弧菌病已經有過多篇記載和報道。梁利國等[18]研究常用中草藥對4種病原弧菌體外抗菌效果中發現，五倍子、蘇木、黃芩、地錦草和石榴皮等對副溶血弧菌具有較好的抑菌效果；王玉娥等[14]研究副溶血弧菌對34種中草藥的敏感性測定試驗中的結果表明，副溶血弧菌對五倍子、黃連和烏梅等具有比較高的敏感性；毛芝娟等[19]的試驗也發現，五倍子煎煮液對溶藻弧菌和副溶血弧菌均有很強的抑菌活性；侯竹美[20]研究證實，五倍子和石榴皮對副溶血弧菌有較強抑菌作用；李華等[21]研究發現，五倍子、石榴皮、黃芩、黃連和烏梅的對副溶血弧菌的抑殺效果較為明顯。本次試驗結果顯示，大菱鲆源副溶血弧菌對黃連、五倍子、秦皮、訶子、石榴皮、黃芩、蘇木、烏梅、連翹和黃柏等均具有很強的敏感性，抑菌直徑達到20 mm以上，其中五倍子、黃連和石榴皮對副溶血弧菌均具有高度的敏感性，抑菌直徑達到25 mm以上，本次試驗結果與上述研究者的研究結果相似。另外，本次試驗結果發現，大黃、當歸和穿心蓮對副溶血弧菌無抑菌作用，該結果與毛芝娟等[19]研究的大黃對鋸緣青蟹源副溶血弧菌具有強的抗菌性結果相反，出現這種情況的原因可能是由于中草藥和供試菌株的不同來源導致藥物對其敏感性存在差異[22]。藥物對弧菌的作用有選擇性的，而不同來源的弧菌對不同藥物的敏感性也是有差異的。因此，在殺滅不同來源弧菌時選擇敏感的藥物顯得尤為重要。

筆者利用微量二倍稀釋法和液體涂布法，進一步確定了本次試驗中具有抑菌效果的21種中草藥對大菱鲆源副溶血弧菌的MIC和MBC。結果發現，五倍子、秦皮、黃連、黃芩、訶子和石榴皮的MIC和MBC最好，抑菌和殺菌效價分別達到了1∶128和1∶64，即MIC和MBC分別為1.56 g/L和3.12 g/L。毛芝娟等[19]研究了石榴皮、五倍子、穿心蓮、大黃等中草藥對副溶血弧菌的抑菌和殺菌作用，發現五倍子煎煮液對副溶血弧菌有很強的抑菌和殺菌作用，MIC和MBC均達到1.56 g/L和3.12 g/L。本次試驗結果也發現五倍子對副溶血弧菌敏感性最好。李華等[21]研究幾種中草藥對海水養殖中常見病原菌的抗菌作用中也發現，五倍子和石榴皮的抑菌殺菌效果最好，而白頭翁效果一般。王玉娥等[14]的研究結果證實，白頭翁對副溶血弧菌效果差。本次試驗結果也發現，白頭翁的MIC和MBC最差，與上述學者研究結果相似。另外，本次試驗結果發現，大菱鲆源副溶血弧菌與其他水產動物來源的副溶血弧菌，抑菌殺菌敏感中草藥的種類具有很高的相似性。因此，在實際生產中可以考慮選用敏感中草藥作為防治不同動物源副溶血弧菌的藥物。

表2 21種中草藥對副溶血弧菌的MIC g/L

注：“-”表示平板上無菌生長或少量菌生長；

“+”表示平板上有大量菌生長。

表3 21種中草藥對副溶血弧菌的MBC g/L

注：“-”表示平板上無菌生長；“+”表示平板上有菌生長。

4 結論與建議

本次試驗采用38種中草藥對副溶血弧菌進行體外抑菌效果測定，結果表明，石榴皮、黃芩、訶子、五倍子、黃連等中草藥的抑菌和殺菌能力最強，其抑菌直徑20～27 mm，MIC和MBC分別為1.56 g/L和3.13 g/L；其次是淫羊藿、青蒿、丁香、地榆、梔子等，抑菌直徑為11～19 mm，其MIC和MBC分別為3.13 g/L和6.25 g/L。在實際生產中建議用價格相對較低，抑菌效果較好的石榴皮、五倍子、黃芩和丁香對大菱鲆源副溶血弧菌進行抑殺。