目的基因大小對脂質體轉染效率影響的研究

丁 旭，郭佳琦，張嘉琪，解宇浩，徐連秀，狄文慧，聶文營，郝 峰

(吉林醫藥學院臨床生物化學檢驗教研室，吉林 吉林 132013)

目的基因導入并表達于真核細胞是確定目的基因生物學活性的必要方法之一，目前常用的目的基因導入方法有電穿孔、病毒介導轉染和脂質體轉染等[1]。其中，脂質體轉染因操作簡單且不需要特殊儀器設備而被廣泛接受[2]。轉染時，不管實際使用的目的基因如何，轉染試劑說明書給出的方法都是相同的。但是實際操作時，不同的目的基因轉染時的效率不同,而轉染效率越高，后續獲得陽性克隆的概率越大。因此，本實驗研究使用脂質體轉染時目的基因大小對轉染效率影響，從而為后續的轉染實驗提供改進措施。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

真核表達載體ANO1-EGFP/pcDNA3.1和YFP/pcDNA3.1由本實驗室前期構建并完成轉化;所用引物由南京諾唯贊公司合成;Lipofectamine 3000脂質體購自Invitrogen公司;質粒提取試劑盒購自北京全式金公司;F-12Ham’s營養培養基購自Sigma公司;血清購自GEMINI公司;FRT細胞由本實驗室保存。

Accuri C6(美國BD)；倒置熒光顯微鏡(日本Nikon)；CO2培養箱(美國Thermo)；超純水機(美國Millipore)；凝膠成像儀(美國Biorad)；Nanodrop 2000(美國Thermo)。

1.2 質粒提取與質量檢測

取已轉化完成的大腸桿菌接入50 mL的2×YT培養基，過夜培養，按照質粒小提取試劑盒說明書裂解細菌提取質粒。提取完成后，用Nanodrop 2000檢測質粒的濃度和純度，按照Lipofectamine 3000試劑要求，取濃度在500～5000 mg/L的質粒備用。

1.3 轉染及轉染效率檢測

轉染使用細胞為FRT細胞，轉染前12 h消化細胞至24孔板，保證轉染時細胞密度達到70%～90%。消化后細胞分為兩組，每組4個孔，一組轉染YFP/pcDNA3.1，另一組轉染ANO1-EGFP/pcDNA 3.1。脂質體每個孔用量按梯度設置為3、4、5、6 μL，兩種質粒每個孔的用量均為1.5 μg。按照說明書混合完轉染試劑和質粒后，室溫孵育20 min。孵育時用PBS溶液清洗細胞，去除殘留的血清。清洗完成后，每個孔中加入450 μL F12完全培養液。脂質體-質粒混合溶液孵育完成后，向每個孔逐滴加入50 μL混合溶液，搖勻后放入CO2培養箱37 ℃孵育48 h。48 h后檢測細胞是否表達目的基因，先在熒光顯微鏡下觀察細胞表達熒光情況，充分消化細胞，利用流式細胞儀檢測表達熒光的細胞數量和細胞總數的比值，實驗重復3次，數據取平均值。

1.4 統計學分析

采用SPPSS13.0統計軟件進行統計學分析，使用GraphPad Prism 5軟件進行作圖。

2 結 果

2.1 質粒提質量檢測結果

質粒使用Nanodrop 2000(美國Thermo)進行檢測，質粒在260 nm處有最高峰，YFP/pcDNA3.1濃度為1 853.4 mg/L,A260/A280為1.84，A260/A230為2.04；ANO1-EGFP/pcDNA3.1濃度為1 103.1 mg/L,A260/A280為1.84，A260/A230為2.01。OD260/OD280=1.8～2.0時，即可說明無蛋白質污染，OD260/OD230=2.0～2.2時，即可說明無醇和鹽的殘留，則ANO1-EGFP/pcDNA3.1和YFP/pcDNA3.1均可認為是純品且濃度符合實驗要求。

2.2 倒置熒光顯微鏡觀測轉染結果

轉染48 h后用熒光顯微鏡觀察，可見轉染了ANO1的部分FRT細胞膜上有綠色熒光，見圖1a，轉染了YFP的部分FRT細胞漿中表達綠色熒光，見圖1b。結果表明，兩種真核表達載體均轉染成功。

a.ANO1在FRT中的表達;b.YFP在FRT細胞中的表達

2.3 流式細胞儀檢測轉染效率

熒光顯微鏡初步判斷轉染是否成功及對比轉染效率后用流式細胞儀檢測，用空白組(未轉染的FRT細胞)設門，清空背景和碎片干擾，并確定未轉染細胞本底表達熒光的發射光范圍。再分別對三次轉染結果進行檢測，檢測結果顯示，YFP和ANO1-GFP在質粒用量為1.5 μg脂質體用量為3、4、5、6 μL時，轉染效率依次上升；每一個濃度梯度，YFP的轉染效率均大于ANO1-GFP的轉染效率。結果見圖2。

三次檢測結果取算數平均數，YFP在質粒用量為1.5 μg脂質體用量為3、4、5、6 μL時，轉染效率分別為9.0%、9.7%、11.2%、11.8%;ANO1在質粒用量為1.5 μg脂質體用量為3、4、5、6 μL時，轉染效率分別為7.6%、8.7%、9.3%、10.8%。經統計學分析，數據具有統計學意義。證實脂質體用量越大，轉染效率越高，且目的基因大小影響用脂質體轉染時的效率，目的基因越大，轉染效率越低。

3 討 論

脂質體轉染因操作簡單且不需要特殊儀器設備而被廣泛接受[3]，目的基因的大小被認為對轉染效率有較明顯的影響[4]。轉染時，不管實際使用的載體如何，轉染試劑說明書給出的方法都是相同的，但是實際操作時，不同的目的基因轉染時的效率不同。而轉染效率越高，后續獲得陽性克隆的概率越大。本研究選用連接在相同載體上啟動子相同而目的基因大小不等的兩種真核表達載體ANO1-EGFP/pcDNA3.1和YFP/pcDNA3.1，梯度設置脂質體用量，選取易于轉染的FRT細胞進行研究。ANO1-EGFP/pcDNA3.1和YFP/pcDNA3.1均表達熒光，便于實驗的觀察和檢測。構建的載體中，ANO1大小為2871 bp,EGFP大小為720 bp，YFP大小為720 bp[5-6]，可以知道ANO1-EGFP大小顯著大于YFP，在相同實驗條件下檢測得YFP的轉染效率高于ANO1-EGFP的轉染效率。因此，本研究證實，無論脂質體用量如何，目的基因大小影響用脂質體轉染時的效率，且目的基因越大，轉染效率越低。研究結果對于今后脂質體轉染工作具有指導作用，脂質體轉染試劑說明書并沒有考慮到目的基因的大小，而不同大小的目的基因使用脂質體轉染時結果差異較大。而轉染效率越高，后續的實驗結果也會更好[7]，并且瞬時轉染的轉染效率越高，后續篩選時獲得陽性克隆的概率越大。所以在不損傷細胞的情況下，目的基因較大時，脂質體用量可以適當增加。后續研究可以針對不同的細胞對脂質體轉染是否有影響，以及確定多大量的脂質體會對細胞產生毒害作用。