多模板分子印跡聚合物磁性固相萃取-高效液相色譜法測定環境水樣中四環素類抗生素

2020-07-03 03:41:20曾國龍馬曉國樊銀明

分析測試學報 2020年6期

曾國龍，馬曉國，樊銀明

(廣東工業大學環境科學與工程學院，廣東廣州 510000)

四環素類抗生素(TCs)是由放線菌產生的一類廣譜抗生素，是我國現階段使用較廣的藥物添加劑，可用于預防和治療動物疾病。其中，具有代表性的四環素(TC)、土霉素(OTC)、金霉素(CTC)、強力霉素(DC)因成本低廉且具有廣譜性而被廣泛用作畜牧業的飼料添加劑和獸藥[1]。四環素類抗生素被動物攝入吸收后，因其代謝性較差，不能在動物體內消化降解，而是以糞便和尿液的形式排出，并進入污水處理系統或水生環境且長期留存于水體中，對生態環境和人體健康造成危害[2]。因此，對環境水體中四環素類抗生素的分析檢測極為重要。目前四環素類抗生素的檢測方法主要有免疫分析法[3]、高效液相色譜法[4]和液相色譜-串聯質譜法[5]等。但這些方法的樣品前處理主要采用傳統的固相萃取，其選擇性差，易導致基質共萃取從而影響目標分析物的測定。因此，建立快速、高效的四環素類抗生素的分析方法具有重要意義。

磁性分子印跡聚合物(MMIP)是融合磁分離與分子印跡功能的一種新型分離材料，同時具有磁性材料的磁響應性和分子印跡聚合物(MIP)對目標物質的特定識別能力[6-9]。利用其磁響應特性，在外加磁場作用下可使之快速聚集，從而極大地提高分離效率[10-11]。目前，基于磁性分子印跡聚合物的固相萃取已廣泛應用于食品檢測[12]、生物分離[13]、環境監測[14-16]等領域。

本課題組曾成功地合成了具有良好性能的介孔硅磁性氧化石墨烯(MGO@MS)復合材料[15]。本文以此材料作為載體，四環素、土霉素、金霉素和強力霉素共同作為模板分子，采用表面分子印跡技術，以溶膠-凝膠法合成了四環素類抗生素多模板分子印跡磁性聚合物。將其作為吸附劑，用于四環素類抗生素的磁性固相萃取，并優化了固相萃取條件。通過進一步與高效液相色譜法相結合，建立了4種四環素類抗生素的同時選擇性檢測方法，評估了方法的分析性能，并成功應用于多種實際環境水樣中四環素類抗生素的分析。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

LC-20A高效液相色譜儀配光電二極管陣列檢測器(日本島津公司)，Sigma HD 場發射掃描電子顯微鏡(SEM,德國蔡司公司)，傅立葉紅外光譜儀(FT-IR,美國賽默飛公司)，SQUID VSM 磁強計( 美國量子設計公司)。四環素類抗生素(四環素、土霉素、金霉素、強力霉素)標準品、甲烯土霉素(MTC)標準品、N-[3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基]乙二胺(KH-792，純度95%)、苯胺基甲基三乙氧基硅烷(KH-42，純度95%)，均購自上海阿拉丁試劑有限公司；正硅酸乙酯、無水乙醇、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、氨水(30%)、硝酸銨均為分析純，購自廣州化學試劑廠；實驗用水均為超純水。

1.2 樣品采集

環境水樣采自廣州市番禺區廣州大學城附近河流、池塘和大學城中心湖，水樣分析前過0.22 μm濾膜以去除懸浮顆粒物。

1.3 標準溶液的配制

分別準確稱取0.01 g四環素、土霉素、金霉素和強力霉素標準品，加入適量水充分溶解后，轉移至100 mL棕色容量瓶中，用水定容配制成100 mg/L的標準儲備液，保存于2 ℃的冰箱中，1周內使用。臨用前用水配制成適當質量濃度的混合標準工作液，現用現配。

1.4 介孔硅磁性氧化石墨烯的制備

按本課題組發表的文獻[15]制備介孔硅磁性氧化石墨烯。將0.5 g磁性氧化石墨烯分散于100 mL水和250 mL無水乙醇的混合溶液中，加入1.5 g CTAB和5 mL氨水(30%)，超聲1 h。機械攪拌下逐滴加入4 mL正硅酸乙酯(TEOS)，室溫下反應24 h。外加磁場收集材料，用1%硝酸銨乙醇溶液于60 ℃下冷凝回流24 h，去除CTAB。磁分離收集材料，用無水乙醇洗滌后，于60 ℃下真空干燥12 h，得到介孔硅磁性氧化石墨烯(MGO@MS)。

1.5 分子印跡聚合物的制備

分別稱取0.01 mmol土霉素、四環素、金霉素和強力霉素混合分散于50 mL無水乙醇中，磁力攪拌使其分散均勻。滴加5 mL水，充分混合后，緩慢逐滴加入KH-792(1.4 mL)和KH-42(0.6 mL)。勻速攪拌4 h后，加入介孔硅磁性氧化石墨烯(0.4 g),磁力攪拌反應24 h后，在外加磁場作用下分離得到反應產物。用甲醇-乙酸(9∶1，體積比)混合溶液對反應產物進行洗滌，去除模板分子。待洗至洗脫液中無模板分子檢出后，用甲醇洗去殘留的乙酸，再真空干燥,得到分子印跡聚合物復合材料(MGO@MS@MIP)。非印跡聚合物(MGO@MS@NIP)的合成除不加模板分子外，其他步驟均與印跡聚合物相同。

1.6 選擇性吸附實驗

將20 mg MGO@MS@MIP或MGO@MS@NIP加至20 mL 50 mg/L的甲烯土霉素、土霉素、四環素、金霉素和強力霉素混合溶液中，室溫下振蕩1 h。磁分離，取上清液過0.22 μm濾膜后用HPLC測定溶液中剩余的抗生素含量。

1.7 磁固相萃取實驗

稱取50 mg MGO@MS@MIP置于圓底燒瓶中，加入75 mL試液，振蕩吸附45 min后，在外加磁場的作用下收集吸附劑，并用1 mL甲醇-醋酸(9∶1,體積比)混合溶液洗脫30 min后，磁分離，取上清液過0.22 μm濾膜，進行HPLC測定。

1.8 HPLC測定條件

Inert Sustain C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫為35 ℃，流動相由甲醇-乙腈-0.01 mol/L草酸水溶液(1∶2∶7，體積比)組成，流速為1 mL/min，PDA檢測波長為355 nm，進樣量為10 μL。

2 結果與討論

2.1 印跡聚合物的表征

采用SEM考察了MGO@MS和MGO@MS@MIP材料的表面形態(見圖1)。可觀察到，MGO@MS具有幾乎規則的球體形狀和光滑表面(圖1A)，而相比于MGO@MS，MGO@MS@MIP的粒徑明顯增加(圖1B)，表明分子印跡聚合物已成功修飾至MGO@MS表面。

圖1 MGO@MS(A)和MGO@MS@MIP(B)的掃描電鏡圖；MGO@MS、MGO@MS@MIP和MGO@MS@MIP的紅外光譜圖(C)；MGO@MS和MGO@MS@MIP的磁滯回線圖(D)Fig.1 SEM images of MGO@MS(A) and MGO@MS@MIP(B);FT-IR spectra of MGO@MS,MGO@MS@MIP and MGO@MS@NIP(C);hysteresis loops of MGO@MS and MGO@MS@MIP(D)

FT-IR常用于材料中官能團的分析。圖1C為MGO@MS、MGO@MS @MIP及MGO@MS@NIP的紅外光譜圖。3條曲線均在490 cm-1處存在Fe-O吸收峰，這是由載體MGO@MS中的磁性Fe3O4顆粒所產生[17]，在1 098 cm-1處較強的吸收峰為材料中Si-O-Si的拉伸振動[18]。在MIP和NIP曲線約3 440 cm-1處觀察到的吸收峰為功能單體的N-H彎曲振動[19]。對MIP和NIP曲線進行比較，發現兩者具有相似的振動吸收峰，表明MIP和NIP具有相似的官能團和結構，這也說明模板分子在印跡材料合成過程中已被完全去除。以上結果表明印跡材料已成功制備。

MGO@MS和MGO@MS@MIP的磁滯曲線如圖1D所示。結果顯示，MGO@MS的飽和磁化強度可達18.12 emu/g。在其表面修飾分子印跡聚合物后，所得產物(MGO@MS@MIP)的飽和磁化強度降至7.05 emu/g。但仍表現出良好的超順磁性，可進行快速的固液分離。

圖2 MGO@MS@MIP和MGO@MS@NIP對四環素類抗生素的吸附選擇性對比Fig 2 Comparison of adsorption selectivity of MGO@MS@MIP and MGO@MS@NIP for tetracycline antibiotics

2.2 MGO@MS@MIP的吸附選擇性

利用結構類似物甲烯土霉素評價MGO@MS@MIP對OTC、TC、CTC和DC(MTC)4種待測物的特異性吸附能力，結果如圖2所示。MIP對MTC、OTC、TC、CTC和DC的吸附量分別為0.27、3.18、2.38、13.12和1.86 mg/g，NIP對上述5種化合物的吸附量分別為0.22、0.45、0.34、1.28和0.30 mg/g。可見，MIP和NIP對4種待測物的吸附量相差較大，對MTC的吸附量則相差不大且遠低于MIP對4種待測物的吸附量。上述研究表明，MGO@MS@MIP對4種待測物具有良好的吸附選擇性。

2.3 磁固相萃取(MSPE)條件的優化

將制備的四環素類抗生素多模板磁性分子印跡聚合物(MGO@MS@MIP)作為吸附劑，用于四環素類抗生素的磁性固相萃取。為獲得最佳的MSPE效果，優化了樣品pH值、樣品體積、萃取和洗脫時間以及洗脫液體積等參數。

2.3.1 樣品pH值的優化在吸附劑用量為50 mg，樣品體積為100 mL，萃取時間為2 h，洗脫時間為1 h條件下，通過調整溶液pH值，測試了不同pH值(pH 4.0～8.0)對TCs提取回收率的影響。如圖3A所示，在pH 4.0～7.0時，4種TCs的回收率隨pH值的增大而增大，且在pH 7.0時回收率最高。這可能是由于低pH值時，吸附劑表面的氨基基團易被質子化，而吸附劑主要通過氨基的氫鍵作用吸附目標化合物，故回收率較低。隨著pH值的升高，氨基去質子化，形成更多的氫鍵參與萃取，因此回收率提高。但繼續增大pH值時，由于氫氧根離子的不斷增加，削弱了吸附劑和目標物之間的氫鍵作用，導致回收率降低。因此，實驗確定固相萃取實驗在中性條件下進行。

2.3.2 樣品體積的優化吸附劑用量保持不變(50 mg)，考察不同樣品體積(50、75、100、150、200 mL)對TCs提取回收率的影響。圖3B顯示TCs的總體回收率趨勢隨溶液體積的增加而降低，這與吸附劑在樣品溶液中的濃度有關，樣品體積較小時，吸附劑濃度高，因而吸附效率提高。考慮到較大體積的水樣可提高方法的靈敏度，且在樣品體積為75 mL時，回收率仍高于90%。因此，實驗設定樣品體積為75 mL。

2.3.3 萃取時間的優化試驗了不同萃取時間(5～90 min)對提取效率的影響(見圖3C)。結果顯示，從5 min到15 min期間，4種TCs的回收率快速增加。這是因為在吸附初始階段，吸附劑表面存在大量吸附位點，且樣品溶液中目標物濃度較高，故目標物能快速占據吸附劑表面的吸附位點，使得吸附量迅速增大。此后回收率的增加速度變緩，直到45 min時，TCs的回收率增至90%以上，繼續延長萃取時間，則回收率幾乎不變，說明此時已達到吸附平衡。因此，實驗選擇最佳固相萃取時間為45 min。

2.3.4 洗脫液體積的優化以甲醇-醋酸(9∶1)作為洗脫液，從吸附劑中解吸OTC、TC、CTC和DC，并考察了不同洗脫液體積(1～5 mL)對TCs回收率的影響。結果顯示，洗脫液體積在此范圍內對回收率幾乎無影響。考慮到在保證洗脫效果的基礎上，應盡可能減少洗脫液的用量，避免對待測物的稀釋。因此，實驗確定最佳洗脫液體積為1 mL。

2.3.5 洗脫時間的優化考察了洗脫時間(5～60 min)對回收率的影響(見圖3D)。結果顯示，在5～30 min范圍內，OTC、TC、CTC和DC的回收率隨洗脫時間的增加而增加，且在30 min時回收率均大于90%。此后，繼續延長洗脫時間，4種TCs的回收率幾乎不變。這說明洗脫時間對回收率有較大影響，洗脫時間較短時，目標物不能完全洗脫，導致回收率較低。而經過30 min洗脫后，吸附劑上的TCs基本被洗脫干凈，回收率接近100%。所以，洗脫時間設定為30 min。

圖3 影響MSPE萃取TCs效果的因素Fig.3 Factors affecting extraction efficiency of TCs by MSPEA:pH value(4.0～8.0);B:solution volume(50～200 mL);C:extraction time(5～90 min);D:elution time(5～60 min)

2.4 方法性能

在優化條件下，將標準儲備液逐級稀釋，得到質量濃度分別為0.5、1、2、5、10、15、20、30、50 μg/L的OTC、TC、CTC和DC系列混合工作溶液，對其進行磁性固相萃取和HPLC測定。發現4種TCs在5～50 μg/L范圍內呈良好線性，線性系數(r2)最高達0.998 2(見表1)。以3倍信噪比(S/N=3)對應的質量濃度為檢出限(LOD)，S/N=10時對應的質量濃度為定量下限(LOQ)，得到4種TCs的LOD為0.67～0.95 μg/L，LOQ為2.13～3.50 μg/L。使用這4種TCs的混合標準溶液(50 μg/L)進行平行實驗(n=6)，以測試精密度，得到4種TCs的相對標準偏差(RSD)為2.3%～5.5%。表明所建立的方法具有較好的靈敏度及精密度。

表1 4種TCs的MSPE-HPLC分析方法參數Table 1 Analytical parameters of MSPE-HPLC method for four TCs

2.5 實際樣品分析

按照“1.7”對3種環境水樣進行分離檢測，分析結果見表2。為驗證方法的可靠性，同時對4種TCs進行加標回收實驗。可以看出，CTC僅在湖水樣品中檢出，質量濃度為2.79 μg/L。OTC、TC和DC則被普遍檢出，其在河水樣品中的質量濃度分別為6.83、9.36、3.64 μg/L，在池塘水樣品中分別為1.68、1.16、1.58 μg/L，在湖水樣品中分別為8.86、9.36、3.13 μg/L。 4種TCs的回收率為82.7%～103%，RSD為1.0%～8.8%。研究表明，所建立的分析方法可用于實際水樣中4種痕量TCs的檢測。圖4為湖水水樣經磁性固相萃取后獲得的高效液相色譜圖。