一種基于分子內質子轉移發色團的硫化氫熒光探針的合成及其生物成像研究

陽 茜，劉存飛，劉夢琴，唐斯萍，胡 萌，韓路嬌，唐東晴，谷 標

(衡陽師范學院 化學與材料科學學院 功能金屬有機化合物湖南省高校重點實驗室，湖南 衡陽 421008)

硫化氫是生物體內的重要氣體信號分子之一[1]。內源性的硫化氫由某些特定酶，如胱硫醚β-合成酶、胱硫醚γ-裂解酶和3-巰基丙酮酸硫轉移酶催化產生[2]。細胞內的硫化氫參與許多生理過程，包括血管擴張、血管生成、細胞生長調節、神經傳遞調節、胰島素信號抑制和炎癥調劑[3]。研究表明，細胞內的硫化氫水平異常與阿爾茨海默病、唐氏綜合征、糖尿病、肝硬化等疾病有關[4]。因此，發展高靈敏、選擇性的方法用于細胞內硫化氫的檢測和成像在生物醫學研究和疾病診斷方面具有重要意義。

傳統的硫化氫檢測方法主要有比色法、電化學分析、氣相色譜法等[5-8]，但這些方法需要昂貴的儀器設備和專業的操作，且大多為破壞性檢測，很難實現生物體內硫化氫的實時、原位檢測。相比之下，熒光探針方法具有操作簡單、靈敏性和選擇性高等優點。結合熒光顯微成像技術，熒光探針可用于生物體內目標分析物的檢測和長期示蹤[9]。

近些年來，國外知名期刊相繼報道了一些用于硫化氫檢測的熒光探針[10-12]。這些探針根據硫化氫的特定化學反應設計，通常分為以下3大類：(1)化學還原：利用硫化氫還原疊氮、硝基、羥胺、二硫化物或硒化物；(2)硫化物沉淀：利用硫化氫與有機銅復合物反應形成硫化銅沉淀；(3)親核反應：利用硫化氫的親核性與熒光探針發生邁克爾加成或者取代反應等。硫化氫熒光探針的研制已取得了很大進展，但尚有待改進，如：(1)選擇性：細胞內含有毫摩爾濃度范圍的谷胱甘肽和其他濃度范圍的半胱氨酸，這些生物硫醇通常對硫化氫的檢測產生干擾；(2)Stokes位移：大部分報道的硫化氫探針Stokes位移小(< 80 nm)，作為檢測探針時，容易受到內濾效應和自吸收的干擾，降低檢測靈敏度；作為成像探針時，易受生物樣品背景熒光的干擾，降低成像信噪比。因此，構建一種選擇性高、Stokes位移大的硫化氫熒光探針尤為重要，同時也具有一定的挑戰性。

圖1 探針DHCD檢測硫化氫的機理示意圖Fig.1 Proposed mechanism for the reaction of DHCD with H2S

具有激發態分子內質子轉移(Excited-state intramolecular proton transfer,ESIPT)性質的化合物，由于存在“醇式-酮式”互變異構現象，在構建熒光探針中具有重要作用[13]。相比其他熒光化合物，ESIPT化合物最顯著的光學性質是具有大的Stokes位移，可有效消除內濾光作用和熒光自吸收效應，增強目標熒光和背景熒光之間的對比度，提高分子的靈敏度[14]。基于以上考慮，本研究設計并合成了一種基于分子內質子轉移(ESIPT)發色團的硫化氫熒光探針(簡稱DHCD,見圖1)。探針DHCD以2-羥基-1-二甲胺基-查耳酮為ESIPT發色團(簡稱DHOH，圖1)，以2,4-二硝基苯基醚為硫化氫的特異識別位點。雖然該探針本身沒有熒光，但在硫化氫與探針發生親核取代反應后，識別基團脫落，產生的游離ESIPT發色團可引起熒光信號增強。研究發現探針DHCD在檢測硫化氫時展現較大的Stokes位移，高的靈敏度和選擇性。更重要的是，該探針具有良好的細胞滲透性和低毒性，能用于活細胞內的硫化氫熒光成像。

1 實驗部分

1.1 試劑及設備

2′-羥基苯乙酮、4-二甲氨基苯甲醛、吡咯烷、2,4-二硝基溴苯、硫氫化鈉(NaHS，作為硫化氫的供體)購于安耐吉化學有限公司。乙醇、二甲基亞砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、碳酸鉀等試劑購于國藥集團上海化學試劑有限公司。2-羥基-1-二甲胺基-查耳酮根據文獻報道方法合成[15]。超純水(≥ 18 MΩ·cm)由Milli-Q純化系統制備。

化合物的氫譜和碳譜經Bruker AVANCE-500M型核磁共振儀測得。紫外光譜和熒光光譜分別用UV-2501型紫外可見分光光度計(Shimazu Co,Japan)和RF-5301PC型熒光分光光度計(Shimazu Co,Japan)測定。細胞熒光成像實驗在倒置熒光顯微鏡(NIKON Eclipse Ti-S，Japan)上進行。

1.2 探針DHCD的合成與表征

將2-羥基-1-二甲胺基-查耳酮(133 mg,0.5 mmol)，2,4-二硝基溴苯(134 mg,0.55 mmol)和碳酸鉀(137 mg,1 mmol)溶解于10 mL DMF，常溫下反應2 h后倒入冰水中，收集沉淀物，用甲醇重結晶后得到黃色固體DHCD(145 mg,67%)。1H NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ8.82(d,J=2.8,1H),8.40(dd,J=9.3,2.8,1H),7.82(dd,J=7.7,1.5,1H),7.71(td,J=8.1,1.6,1H),7.52(dd,J=17.1,8.2,3H),7.43～7.36(m,2H),7.11(d,J=9.3,1H),7.04(d,J=15.7,1H),6.68(d,J=8.9,2H),2.99(s,6H)；13C NMR(126 MHz,DMSO-d6)δ190.27,155.72,152.69,151.02,147.22,141.64,139.17,133.64,133.27,131.27,131.10,130.00,127.41,122.62,122.29,121.66,119.86,119.05,112.15,101.64,40.10。

1.3 樣品配制與測試

用分析天平稱取一定量的探針DHCD溶解在DMSO中，配成濃度為1.0 mmol/L的DHCD標準液，保存在4 ℃冰箱中待用；分別稱取一定量的NaHS和其他分析物質(金屬鹽、生物硫醇等)溶解在超純水中，配成濃度為1.0 × 10-2mol/L的標準液，保存在4 ℃冰箱中待用。向測試管(2 mL)中加入探針DHCD儲備液(20 μL)和適量的分析物標準液，用磷酸鹽(PBS)緩沖液(10 mmol/L，pH 7.45)定容至刻度線處。待混合液孵育75 min后，在熒光分光光度計上測定熒光強度，熒光光譜儀的激發波長設置為382 nm，記錄450～675 nm之間的發射光譜。

1.4 細胞培養與成像

將HeLa細胞接種在96孔板中，在細胞培養箱(37 ℃，含5% CO2)中，用10%小牛胚胎血清的DMEM(杜爾貝科改良伊格爾培養基)培養24 h。然后，將細胞轉移到含有DHCD(10 μmol/L)的培基中，孵育30 min后用PBS洗滌2～3次，作為空白組。將一部分經DHCD處理的細胞轉移到含有NaHS(200 μmol/L)的培基中，孵育75 min后用PBS洗滌2～3次，作為實驗組。最后，用倒置熒光顯微鏡(NIKON Eclipse Ti-S，Japan)觀察并拍攝兩組細胞的圖像。

2 結果與討論

2.1 可行性研究

在合成探針DHCD后，測試探針與NaHS作用前后的紫外吸收光譜和熒光光譜，證明探針識別硫化氫的可能。如圖2A所示，探針在348 nm處有一個最大吸收峰，該峰歸因于探針分子結構中的π-π*電子躍遷，而在加入NaHS后，溶液的紫外吸收光譜發生紅移，在382 nm處產生最大吸收峰，表明溶液中有新物質產生。圖2B為探針與NaHS作用前后的熒光光譜，在382 nm光激發下，探針的熒光較弱(Ф=0.048)；而在加入NaHS后，溶液在513 nm處的熒光信號明顯增強(Ф=0.375)，這可能是因為探針結構中的2,4-二硝基苯在NaHS作用下脫去，導致熒光恢復。此外，探針與硫化氫作用后，Stokes位移高達165 nm，在生物分析中，如此大的Stokes位移可有效減少內濾作用，降低自發熒光的干擾，提高檢測的靈敏度和成像的分辨率。

圖2 探針DHCD與NaHS作用前后的紫外吸收光譜(A)和熒光光譜(B)Fig.2 Absorption(A) and fluorescence(B) spectra of probe DHCD(10 μmol/L) without and with NaHS(200 μmol/L) in PBS-DMSO buffer(99∶1,by volume,pH 7.45)

圖3 探針DHCD與不同濃度NaHS作用后的熒光光譜Fig.3 Fluorescence spectra of DHCD(10 μmol/L) upon addition of different concentrations of NaHS PBS-DMSO buffer(99∶1,by volume,pH 7.45)

2.2 檢測機理

為了確定探針與硫化氫的作用機理，測試了探針DHCD與NaHS作用前后的核磁氫譜。在探針與NaHS作用前，2,4-二硝基苯基上的3個質子信號峰位于8.8、8.3、7.7 ppm，而在加入NaHS之后，這3個質子信號峰消失，同時在13.2 ppm處新出現1個歸屬于酚羥基的特征質子信號峰，表明探針DHCD與硫化氫發生巰解反應，釋放出熒光基團。結合相關文獻報道[16-17]，推測探針DHCD檢測硫化氫的可能機理如圖1所示。

圖4 探針DHCD(10 μmol/L)與不同物質(200 μmol/L)作用前后的熒光強度矩形圖Fig.4 Fluorescence responses of DHCD(10 μmol/L) for various analytes(200 μmol/L) black bars represent the addition of a single analyte,red bars represent the subsequent addition of NaHS(200 μmol/L) to the mixture；SCN-,CH3COO-，respectively

2.3 靈敏度

為了探究探針的靈敏度，測試了DHCD(10 μmol/L)與不同濃度NaHS(0～200 μmol/L)在PBS-DMSO緩沖液(99∶1,體積比,pH 7.45)中的熒光光譜。從圖3可知，探針的熒光強度隨著NaHS濃度的增加而增加。更重要是，探針DHCD在513 nm處的熒光強度與NaHS的濃度在0～10 μmol/L范圍內呈現良好的線性關系：Y=0.141 4+0.006 4X,r2=0.997 5(X為NaHS濃度，μmol/L，Y為歸一化熒光強度)。根據檢出限計算公式(LOD=3σ/k，σ為空白樣品連續測定11次的標準偏差，k為標準曲線斜率)[18]，求出當前方法對硫化氫的檢出限為0.84 μmol/L，該值遠低于正常人體內硫化氫的含量[19]。上述結果表明探針DHCD對硫化氫具有較高靈敏度，并能通過熒光光譜定量檢測體外硫化氫的含量。

2.4 選擇性

除靈敏性外，選擇性也是評價探針優劣的一個重要指標。為證明DHCD對硫化氫的專一性，對探針與其他物質(生理相關的陽離子、陰離子、硫醇)的熒光響應情況進行研究。如圖4所示，在NaHS存在下，探針產生明顯的熒光增強信號，而在其他物質存在下，探針的熒光幾乎不變。更重要的是，這些被測試的物質很難干擾探針對NaHS的檢測。上述實驗結果表明DHCD對硫化氫具有良好的選擇性和抗干擾性，滿足生物樣品中硫化氫的檢測要求。

2.5 熒光顯微成像

鑒于DHCD在體外實驗中對硫化氫優良的識別性能(Stokes位移大、靈敏性和選擇性高)，利用DHCD對細胞內的硫化氫進行熒光成像。如圖5所示，將HeLa細胞與DHCD(10 μmol/L)孵育30 min后，細胞內觀察不到熒光信號(圖5B)。然而，將細胞放置在含有NaHS(200 μmol/L)的培基中，孵育75 min，可以看到細胞內有明亮的綠色熒光產生(圖5D)。從圖5A和圖5C可以觀察到，細胞生長狀態良好，這說明DHCD具有較好的生物相容性和低的細胞毒性。上述實驗證明本研究中的探針具有較好的細胞膜通透性，適合機體中硫化氫的成像分析。

3 結 論

本研究制備了一種基于分子內質子轉移發色團的硫化氫熒光探針(DHCD)，該探針與硫化氫作用后展現明顯的熒光“關-開”變化，同時伴隨大的Stokes位移。光譜分析表明DHCD對硫化氫具有較高的靈敏度和選擇性，且不受其他生理相關物質的干擾。更重要的是，該探針具有良好的生物相容性，可用于活細胞中硫化氫的熒光成像。因此，本工作為深入研究機體內硫化氫的生理及病理作用提供了一種強有力的分析方法。

圖5 HeLa細胞與DHCD(10 μmol/L)孵育30 min后的明場圖(A)及熒光成像圖(B)，經DHCD處理的HeLa細胞與NaHS(200 μmol/L)繼續孵育75 min后的明場圖(C)及熒光成像圖(D)Fig.5 Bright field image(A)and fluorescence image(B)of HeLa cells after being treated with DHCD(10 μmol/L) for 30 min， and bright field image(C) and fluorescence image(D) of HeLa cells preincubated with DHCD(10 μmol/L) for 30 min and then incubated with NaHS(200 μmol/L) for 75 min