電噴霧-差分電遷移率-粒子計數法絕對定量分析牛血清白蛋白

劉 洋，米 薇，李紅梅，胡志上

(1.北京化工大學 生命科學與技術與技術學院，北京 100029；2.中國計量科學研究院，北京 100013)

面對越來越多的蛋白類藥物的研發生產以及上市，市場對蛋白質及肽類藥物藥性分析的需求日益增大，對定量表征技術也提出越來越高的要求。蛋白含量測定是蛋白質藥物質量控制中的重要指標之一，準確的蛋白質含量測定對比活性計算、殘留雜質的限量控制、產品的分裝以及其他理化性質測定均具有重要意義[1]。

與傳統的化學小分子藥物相比，蛋白質類藥物具有結構復雜，相對分子質量較大，存在內源性干擾以及生產工藝復雜等特點，分析檢測難度較大。常用的蛋白質定量分析方法包括分光光度法[2]、比色法[3-4]、生物檢定法[5]、氨基酸分析[6-7]以及質譜分析技術[8-10]。但現有的蛋白質定量方法存在精度不足、誤差較大、費時費力等缺陷，定量分析依賴于內標或外標，對結構復雜、分子量大的蛋白質定量研究的能力不足，定量結果的準確性和重復性亟待提高。因此，建立和豐富準確并快速的蛋白定量技術具有現實意義。

電噴霧-差分電遷移率-粒子計數(Electrospray-differential mobility analysis-condensation particle counter,ES-DMA-CPC)分析技術根據不同大小的帶電粒子在電場中遷移率不同，對獲得的不同電遷移率直徑的粒子進行計數，具有無需樣品預處理、靈敏度高、耗時短、耗樣量少、檢測范圍廣等優勢，在生物領域的應用越來越廣泛[11-13]。ES-DMA-CPC目前已經應用于病毒顆粒分析[14]、蛋白顆粒的表征[15-16]、納米金顆粒研究[17-18]和生物納米粒子交聯[19-20]等方面，同時電噴霧(ES)電離過程產生的液滴誘導聚集效應[21]，為蛋白定量提供了新的途徑。Bacher等[22]利用該技術分析了20多種不同的蛋白質，Li等[23]提出了生物納米顆粒非特異性聚集回歸模型的絕對量化方法，Clouet-Foraison等[24]在絕對量化方法的基礎上將其應用于脂蛋白顆粒濃度測量。

本研究利用該技術，搭建了一套ES-DMA-CPC計量裝置，系統考察和優化了實驗條件，建立了基于ES-DMA-CPC的蛋白質定量分析技術，并應用于牛血清白蛋白標準物質的定量測定，測定結果與標準物質濃度相符。本方法無需復雜的樣品前處理，通過較少的樣品即可快速準確得到蛋白質濃度，為蛋白質定量提供了一種新的分析方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

3482型電噴霧氣溶膠顆粒發生器、3082型靜電分級器、3788型納米水基凝聚核粒子計數器、二氧化硅毛細管(內徑25 μm，長度4.07 cm)(TSI，USA)；FLOW-EZ微流體恒流泵(Fluigent，France)。

蔗糖(D-(+)- 蔗糖，純度99.9%，Sigma，USA)；乙酸銨(色譜級，純度≥99.0%，Honerwell，German)；牛血清白蛋白標準物質(GBW09815)、牛血清白蛋白溶液標準物質(BW3627-1)(中國計量科學研究院)；實驗用水為超純水。

1.2 樣品準備與標準溶液配制

實驗中所有樣品采用質量稀釋法制備。取適量乙酸銨配制成20 mmol/L緩沖液，過濾并調至pH 7.0(緩沖液的pH值應高于BSA的等電點(pI)以防止蛋白質吸附在壁上)。0.063%(體積分數)蔗糖溶液由10%(體積分數)的蔗糖溶液過濾制備得到。將牛血清白蛋白標準物質采用重量法配制成20.0 g/L的牛血清白蛋白溶液，并稀釋成100、50、25、10、5 mg/L的樣品溶液；將牛血清白蛋白溶液標準物質(69.4 g/L)稀釋成495.7、198.3、99.0、49.5、19.8、9.9 mg/L的樣品溶液。重復實驗時需要重新制備上述樣品溶液梯度。樣品采集選用3(Scans per sample)×3(Number of samples)的方式，以保證實驗數據的重復性和準確性。

1.3 實驗條件及參數

電噴霧-差分電遷移率-粒子計數分析技術的實驗裝置原理圖如圖1所示，完整的ES-DMA-CPC主要由3部分組成，包括電噴霧氣溶膠顆粒發生器(ES)、粒子分選器(DMA)和凝結核顆粒計數器(CPC)。首先將樣品通過微流體恒流泵注入電噴霧氣溶膠顆粒發生器中，通過25 μm內徑的毛細管產生霧化的高電荷液滴，液滴蒸發干燥后，根據電荷殘余機制，余下的帶電粒子即待分析蛋白樣品通過DMA納米柱，最終在CPC中獲得粒子的總數。本研究采用更常見的內徑25 μm的二氧化硅短毛細管(長度4.07 cm)，以干燥的空氣和二氧化碳氣體作為載氣。DMA鞘流流速設定為6 L/min，CPC取樣流速設定為0.6 L/min,DMA直徑掃描范圍設定為3.16～107.5 nm。

2 結果與討論

2.1 蔗糖顆粒的選擇

基于ES-DMA-CPC的蛋白定量分析，需要了解電噴霧發生器產生的液滴尺寸。對低濃度的蔗糖和蛋白質顆粒來說，溶液的粘度受緩沖條件控制，具有相同緩沖條件的蔗糖溶液和蛋白溶液的液滴尺寸預計是相同的[25-26]。因此本研究通過對蔗糖粒徑的測試分析，系統考察了影響蛋白質定量分析的相關參數。

圖1 電噴霧-差分電遷移率-粒子計數法示意圖Fig.1 Diagram of electrospray-differential mobility analysis-condensation particle counter(ES-DMA-CPC)

2.2 ES-DMA-CPC參數優化

2.2.1 電噴霧電壓電噴霧電壓造成的液體噴射模式對蔗糖粒徑分布的影響如圖2所示。樣品溶液流速分別為0.1、0.3、0.5、1 μL/min，結果顯示泰勒錐模式下蔗糖粒徑分布明顯較窄，粒徑值較小。為保證實驗測量的穩定性和準確性，控制待分析樣品溶液的電噴霧在泰勒錐模式下進行測量[19-20]。本研究選擇電噴霧電壓在1.7～1.9 kV范圍內，以保證在泰勒錐模式下進行研究。

圖2 低電壓模式(a)和泰勒錐模式(b)蔗糖粒徑分布比較Fig.2 Comparison of sucrose particle size distribution between low voltage mode(a) and Taylor cone mode(b) sucrose sample flow rate(A-D)：0.1，0.3，0.5，1 μL/min

2.2.2 樣品溶液流速電噴霧產生的液滴尺寸大小對蛋白質定量意義重大，而液滴的尺寸由樣品溶液流速和樣品溶液的電導率控制。“2.2.1”中已確定本研究在穩定的泰勒錐狀態下進行，而在確定的溶液濃度(即蔗糖溶液)下，穩定的泰勒錐模式受溶液電導率的影響[25]，實驗中樣品溶液的電導率由緩沖溶液乙酸銨決定，因此本研究中液滴的尺寸由樣品溶液流速控制[25-28]。

考察了樣品溶液在0.1～1 μL/min流速梯度下蔗糖的粒徑分布(圖3A)，該條件下蔗糖的粒徑值以及峰寬(FWHM)值分布見圖3B。結果顯示，蔗糖粒徑隨著樣品溶液流速的降低而減小，粒徑分布隨著樣品溶液流速的降低而變窄。由此可知，較低流速產生分布較窄、粒徑較小的電噴霧液滴，因此實驗中樣品溶液流速除應保證實驗樣品溶液產生穩定的錐形噴射不出現斷流現象外，還應使FLOW-EZ微流體恒流泵瞬時流速保持穩定。結果顯示，對于BSA樣品，樣品溶液最佳流速為300 nL/min。

圖3 在0.1 μL/min到1 μL/min樣品溶液流速梯度下蔗糖的粒徑分布(A)和粒徑值(Dd)以及峰寬值(FWHM)分布(B)Fig.3 Particle size distribution(A)and particle size of the dried sucrose(Dd) and the distribution of peak width(FWHM) values(B)of the sample solution with flow rate from 0.1 μL/min to 1 μL/min

圖4 不同空氣流速下的蔗糖粒徑分布Fig.4 Sucrose particle size distribution at different air flow rates

2.2.3 氣體流速空氣和二氧化碳為本研究的實驗載氣。空氣的作用是將電噴霧產生的顆粒輸送進DMA和CPC，二氧化碳的作用是防止毛細管尖端電弧的產生。故通過改變空氣流量來改變載氣流量。本文二氧化碳流量設置為儀器默認值，即0.1 L/min。載氣流量的變化即ES腔室壓力變化可改變液滴尺寸。本研究通過蔗糖粒徑的變化來反應液滴尺寸的變化。如圖4所示，在液體流速為300 nL/min，泰勒錐模式電壓條件下，當二氧化碳流速為0.1 L/min，若空氣流速為1.0 L/min時，蔗糖粒徑分布更窄，粒徑更小。因此，選擇氣體流速為二氧化碳0.1 L/min，空氣1.0 L/min。

2.3 蛋白質濃度絕對定量

蛋白質濃度絕對定量方法基于電噴霧(ES)電離過程中的液滴誘導聚集進行統計分析[23]。待分析蛋白在ES過程中完全蒸發后以帶電殘留物的形式存在，因此遵循電荷殘留機制。該電荷殘留機制表明液滴誘導聚集效應存在，即DMA觀察到的結果中，存在一個液滴中包裹兩個單體誘導聚集形成二聚體的現象。Li等[23]通過建立統計模型進行研究，發現觀察到的二聚體與單體的比值在統計學上與溶液中原始蛋白質的濃度有關。這種統計模型的建立表明，基于理論推導，根據ES-DMA-CPC對蛋白樣品的單體和聚集體以及液滴尺寸進行測量，可以對蛋白樣品進行定量分析。

2.3.1 液滴尺寸計算根據電荷殘余機制，隨著溶劑的蒸發，液滴可能會保持球形，此時液滴半徑非常接近顆粒半徑。通常可將顆粒遷移率表示為等效球形直徑，而與其實際形狀無關。因此通過蔗糖顆粒直徑的測量分析表征，即可獲得蛋白樣品顆粒直徑。

本研究通過使用體積分數為0.063%的蔗糖溶液來評估確定原始液滴的尺寸[25]。

(1)

式中，D代表液滴直徑，Ds代表干燥的蔗糖顆粒直徑(ES-DMA-CPC測量得到)，Cs代表已知的體積分數的蔗糖溶液(本文中Cs=0.063%)。

2.3.2 BSA定量結果實驗中只觀察到單體、二聚體和三聚體，所以蛋白定量計算截止至三聚體。只考慮簡單情況，即ES發生器產生體積為Vd的單分散液滴，根據泊松分布分析，通過對“觀察到的”單體和二聚體(No1，No2)以及液滴尺寸的測量，二聚體和單體數量濃度的比值(No2/No1)與樣品稀釋倍數m存在某種線性關系，擬合式(2)即獲得單體Cp1和二聚體Cp2的絕對數濃度，然后通過式(3)確定三聚體濃度Cp3。總濃度可以通過式(4)求和來確定[22]。

(2)

(3)

Cp=Cp1+2Cp2+3Cp3

(4)

式中，No1、No2、No3為“觀察到的”單體、二聚體和三聚體的數量濃度，即ES-DMA-CPC測量得到的單體、二聚體和三聚體的數量濃度；Cp1、Cp2、Cp3為待分析樣品中單體、二聚體和三聚體的數量濃度；Cp為待分析樣品的質量濃度(g/L)；m為稀釋倍數。由于蛋白樣品的差異，實驗中只觀察到單體和二聚體，故計算結果截止到二聚體。

根據上述理論以及方法，對牛血清白蛋白標準物質(GBW09815)進行定量分析，采用同位素稀釋質譜法定值，純度為0.963 g/g，擴展不確定度為0.038 g/g(k=2)。使用該標準物質配制20.0 g/L的牛血清白蛋白溶液進行測定，即該蛋白樣品溶液標準質量濃度為19.26 g/L。以牛血清白蛋白溶液標準物質(BW3627-1)的定量結果進行驗證，其標準值為69.40 g/L(U=4.6 g/L，k=2)。將兩種樣品的梯度稀釋液分成3組，每組重復測定3次，定量結果見表1。由表1可知，牛血清白蛋白標準物質(GBW09815)配制的牛血清白蛋白溶液平均定量結果為20.05 g/L，牛血清白蛋白溶液標準物質(BW3627-1)定量驗證的平均結果為69.52 g/L。本法與標準物質BSA定值(同位素稀釋質譜法)的相對誤差在±5%以內，說明本方法具有準確性和等效性。

表1 BSA濃度定量Table 1 Quantifying concentration of BSA

*due to the high concentration of the sample BSA solution(BW3627-1),the capillaries cloged seriousiy,so the experimental data included 3 groups(樣品BSA solution(BW3627-1)由于濃度較高，引發毛細管堵塞情況嚴重，因此其收錄實驗數據為3組)

3 結 論

基于ES-DMA-CPC，采用常規的二氧化硅毛細管，在探究蔗糖粒徑分布參數的條件下，建立了快速準確的蛋白質濃度定量方法，并采用標準物質驗證了方法的準確性。與其他蛋白定量技術相比，電噴霧-差分電遷移率-粒子計數分析技術耗時更短，靈敏度更高，樣品無需復雜前處理，在大分子蛋白類藥物的定量分析中顯示出良好的應用前景。