基于胸腺嘧啶堿基錯配的汞離子傳感器研究進展

王久軍，吳 亞，馬博文，張興平

(長江大學 生命科學學院，湖北 荊州 434025)

汞在自然界中多以化合物形式存在，通常被應用于各種含汞化學藥品的制備以及相關電子產品的生產。在開發汞區域的水、空氣和土壤中存在著大量汞單質、汞離子以及汞蒸氣[1]，它們可通過食物鏈在人體中富集，并和人體內含硫氨基酸如甲硫氨酸、半胱氨酸等通過Hg-S鍵結合導致氨基酸功能缺失，且一旦被環境中微生物轉化為甲基汞，將引起腦部、肝、腎臟等部位更嚴重的疾病，極大地威脅著人類的健康[2-3]。以汞為代表的重金屬污染隨著工業的發展仍在不斷加劇，2013年研究人員在對浙江省343種蔬菜重金屬含量的檢測中發現，鉻和汞的平均含量分別為0.015 mg/kg和0.022 mg/kg，其中4.37%樣品中鉻含量和2.62%樣品中汞含量已超過中國法律規定的最大允許濃度(MACs)[4]；在我國貴州礦區及相關工業區的土壤中，汞含量超過正常農田的幾十倍，這對環境造成了嚴重危害[5]。為了降低汞污染，保證環境衛生及食品安全，國內外對相關領域發布了衛生標準，中國衛生部規定飲用水中汞單質含量不得超過0.001 mg/L(約4.9 nmol/L)，含汞氯化物不得超過250 mg/L(約0.92 mmol/L)，美國環境保護協會(EPA)規定飲用水中汞單質含量不得超過2.0 ppb(約10 nmol/L)[6]。為了更嚴格防治汞污染，相關領域衛生標準可能將進一步加強，因此人們需要開發更加靈敏、高效的汞離子生物傳感器以滿足日益嚴格的檢測要求。

傳統檢測汞離子的方法多是基于大型儀器，如光譜法、色譜法。其中，光譜法主要有原子吸收光譜法[7-8]、原子發射光譜法[9-10]；色譜法主要有高效液相色譜法[11]、色譜-質譜聯用法[12-13]。這些方法已經被成熟運用于各個領域的汞離子檢測，其靈敏度和準確度也已得到充分驗證，但該類方法對操作人員的專業性要求較高且依賴大型昂貴檢測設備，難以達到便捷高效的檢測要求。研究發現[14-15]兩個胸腺嘧啶(T)的-NH3殘基通過與汞離子發生質子取代反應產生Hg-N共價鍵，并最終形成T-Hg(Ⅱ)-T復合物。在體系中胸腺嘧啶的該殘基可作為汞離子傳感器良好的識別基團，特異性地識別汞離子。自該現象被發現起，T-Hg(Ⅱ)-T被廣泛用于汞離子探針的設計與開發[16-20]。根據不同的信號輸出方式，這類探針大致可分為3大類：基于簡單電子媒介體的汞離子傳感器、基于納米粒子及量子點材料的汞離子傳感器、基于免標記核酸探針的汞離子傳感器，部分檢測方法已在實際應用中表現出良好性能。本文對上述3種類型的汞離子生物傳感器展開介紹，以期為今后汞離子的檢測提供參考。

1 基于簡單電子媒介體的汞離子傳感器

1.1 電子媒介體電化學探針

該類型傳感器通常利用在多聚胸腺嘧啶核苷酸鏈(PolyT DNA)末端標記電子轉移載體或在催化液中添加底物，通過汞離子與核苷酸的結合導致電子轉移載體與電極表面的空間距離發生變化，以實現電子轉移通道的建立與阻斷，或者使電極表面的通透性發生改變，導致探針分子在電極表面發生氧化還原反應的效率產生差異，從而產生電信號的變化[21]。2015年，Tortolini等[22]設計了多聚胸腺嘧啶核苷酸鏈修飾的金電極(如圖1)，在核苷酸3′末端標記亞甲基藍(MB)作為氧化還原探針，汞離子的存在導致核苷酸形成發卡結構，亞甲基藍與金電極表面的距離拉近后，金電極表面的電子增多引起電流的增加，從而實現了溶液中汞離子的檢測。Si等[23]同樣在金電極表面固定多聚胸腺嘧啶核苷酸鏈，當體系中不存在汞離子時，自動延伸形成的多聚腺嘌呤核苷酸鏈(PolyA DNA)可與PolyT DNA互補，在亞甲基藍氧化還原作用下產生較高的電信號；若存在汞離子，金電極上形成的T-Hg(Ⅱ)-T導致標記亞甲基藍的DNA無法固定，電信號減小。與金電極相比，氧化銦錫(ITO)電極也具有很好的導電性能且成本比金電極低，Fu等[24]制備亞甲基藍標記的多聚胸腺嘧啶核苷酸鏈及其含多聚胸腺嘧啶的部分互補鏈，當體系中不存在汞離子時，在核酸外切酶Ⅲ(ExoⅢ)降解作用下剩余含較長序列的單鏈，由于靜電排斥導致其難以靠近帶負電荷的ITO電極表面；當存在汞離子時，T-Hg(Ⅱ)-T結構的形成導致形成完整雙鏈，可被Exo Ⅲ完全降解，ITO電極表面對較短的核苷酸片段排斥力減小，附著在電極表面后導致電化學信號增強。該方法已成功應用于水中汞離子的檢測。基于T-Hg(Ⅱ)-T識別的簡單電子媒介體探針依賴電極與電子載體的結合與阻斷，實現了便捷高效的汞離子檢測，在合適的電子載體下，利用循環放大作用可檢測超痕量汞離子。

圖1 基于金電極與亞甲基藍的電化學探針原理圖Fig.1 Schematic diagram of electrochemical probe based on gold electrode and methylene blue

1.2 電子媒介體光信號探針

針對不同檢測場景，開發出了基于電子媒介體光信號探針對汞離子進行檢測的方法，其中常用方法是基于電子轉移引起的能量變化，如分子內電荷轉移(ICT)和熒光能量共振轉移(FRET)，分別利用具有特殊汞離子結合位點的共軛與非共軛化合物上電子轉移通道的阻斷與恢復，實現汞離子介導下的電子受體能量變化，使得受體最大吸收波長產生偏移，并引起熒光變化。Li等[25]設計了基于T-Hg(Ⅱ)-T和氮化石墨(g-C3N4)的汞離子傳感器，多聚胸腺嘧啶核苷酸單鏈(ssDNA)通過π-π堆積附著在氮化石墨的表面，汞離子的存在使得ssDNA形成發卡結構的dsDNA，當汞離子非常接近g-C3N4表面時，g-C3N4電子向汞離子發生轉移，導致熒光猝滅。Long等[26]設計了基于分子內電荷轉移(ICT)的七甲川花菁染料(如圖2)，將氟化的胸腺嘧啶基團修飾至七甲川花菁染料，在汞離子存在下形成T-Hg(Ⅱ)-T復合物，染料基團內電荷可轉移至汞離子，且氟的引入通過形成分子間氫鍵進一步促使染料基團聚集，熒光進一步猝滅，該方法可用于細胞線粒體中汞離子的快速檢測。但熒光猝滅型探針在檢測難易度及抗干擾性能上存在不足，熒光增強型探針相較而言具有一定優勢，Sun等[27]制備了單胸腺嘧啶參與形成的共軛聚合物(CPs)，基于聚集誘導發光效應(AIEE)設計了汞離子熒光探針。通過胸腺嘧啶作為汞離子識別與結合位點，實現汞離子誘導的CPs聚集，由于在CPs基團中引入熒光染料四苯基乙烯(TPE)，故CPs的熒光信號可隨聚合效應增強。Huang等[28]合成了一種以Cu2+為中心，以共軛三羧酸基團為配體的金屬-有機骨架化合物(MOF)，該化合物可通過π-π堆積、靜電相互作用及氫鍵緊密吸附于熒光素(FAM)標記的富T單鏈DNA上，在光誘導電子轉移(PET)作用下熒光猝滅。而汞離子的存在促使T-Hg(Ⅱ)-T發卡結構形成，并使MOF從DNA上釋放，熒光恢復，進一步通過熒光“off-on”轉換過程實現其他部分生物硫醇的快速檢測。部分電子媒介體光信號探針的檢測范圍和檢出限與電化學探針相比無明顯差別。因此，針對不同應用場景，可選擇合適的檢測方法。

圖2 基于七甲川花菁染料的光信號探針原理圖Fig.2 Schematic diagram of optical signal probe based on heptamethine cyanine dye

2 基于納米粒子/量子點探針的汞離子傳感器

2.1 納米粒子/量子點電化學探針

金/銀等納米顆粒由于具有良好的導電性、較大的比表面積及生物相容性，已被廣泛應用于分析檢測領域。通過將納米顆粒附著在電子供體如石墨烯材料上，同時附著多聚胸腺嘧啶核苷酸鏈作為汞離子的結合位點，基于納米粒子-核苷酸鏈復合物所含電子發生轉移導致的電信號變化，從而可實現汞離子的檢測。Jin等[29]制備金納米棒官能化的氧化還原石墨烯材料，負載硫堇和鏈霉抗生素蛋白作為信號放大基團(RGO@AuNR-TH-SA)，同時制備富含胸腺嘧啶的DNA S1附著的金電極板(S1-AuE)。當體系中存在汞離子時，S2可通過T-Hg(Ⅱ)-T復合物成功與MCH-S1/AuE反應，并且RGO@AuNR-TH-SA可以連接至Hg2+/S2/MCH-S1/AuE ，通過鏈霉抗生素蛋白SA與DNA的特異性結合，實現了電信號的增強，該方法可以實現汞離子的痕量檢測。Yu等[30]將金納米顆粒(AuNPs)修飾的蒲公英狀氧化銅微球D-CuO/Au復合物在電極表面固定并干燥后，在Au-S共價鍵的作用下使硫甙寡核苷酸鏈P1附著在含有D-CuO/Au復合物的電極表面，再加入寡核苷酸鏈P2與待測樣品(見圖3)，若樣品中含有汞離子，則形成T-Hg(Ⅱ)-T結構，并在“發卡”探針H1-H2的自組裝及甲苯胺藍(TB)信號放大的作用下，通過電信號變化實現對汞離子的痕量檢測。

圖3 基于金納米顆粒的電化學探針檢測汞離子原理圖Fig.3 Schematic diagram of gold nanoparticle-based electrochemical probe detection of mercury ions

2.2 納米粒子/量子點光信號探針

量子點材料于2004年由Xu等[31]首次報道，量子點材料擁有比納米材料更小的納米尺度，更好的光學、電學及生物相容性質，在結合功能化基團后可用于生物成像，實現生物大分子或無機離子的檢測。2019年Ma等[32]將帶負電荷的銀納米簇附著在多聚胸腺嘧啶核苷酸鏈的一端，帶正電的金納米顆粒在靜電吸附作用下靠近銀納米簇使其熒光被猝滅，在體系中汞離子作用下形成T-Hg(Ⅱ)-T結構，同時在核酸外切酶Ⅲ(ExoⅢ)作用下降解該片段，缺失固定模板的銀納米簇與金納米顆粒得以釋放，銀納米簇部分熒光恢復，且繼續在ExoⅢ作用下完成體系的熒光信號循環放大過程，實現對汞離子的痕量檢測。Cui等[33]將多聚胸腺嘧啶核苷酸鏈標記的碳量子點(OND-CDs)通過疏水作用與共價鍵吸附在石墨烯(GO)表面使碳量子點熒光猝滅(見圖4A)，當體系中存在汞離子時，通過形成T-Hg(Ⅱ)-T復合物使得核苷酸單鏈形成雜交雙鏈以避免被GO吸附，因熒光能量共振轉移(FRET)通道被阻斷而導致碳量子點熒光恢復，從而實現對汞離子的微量檢測。Guo等[34]分別制備多聚胸腺嘧啶核苷酸鏈P1、P2修飾的CdTe量子點作為熒光信號輸出，當汞離子存在時，溶液中兩種量子點復合物通過T-Hg(Ⅱ)-T結構粘合在一起，形成聚集體的量子點(QDs)產生激子能量轉移效應，從而導致光譜帶紅移及熒光信號降低。Gao等[35]利用雙鏈DNA修飾的金納米粒子(dsDNA-AuNPs)進行非交聯聚集和共振瑞利散射(RRS)，設計了一種汞離子敏感性檢測方法，其檢測限為0.4 nmol/L。Li等[36]以山藥為氮、碳源，采用水熱法制備氮摻雜碳量子點(CNDs)，結合多聚胸腺嘧啶核苷酸鏈用于檢測汞離子。此外，利用納米粒子或量子點設計汞離子檢測探針，在選擇易制備、易表征、量子產率高的材料后，其通用的傳感策略還可用于其他金屬、小分子和蛋白質的檢測。

圖4 基于碳量子點的光信號探針(A)及基于黃連素的免標記核酸探針(B)檢測汞離子原理圖Fig.4 Schematic diagrams for detection of mercury ions based on carbon quantum dot optical signal probe(A) and berberine-based label-free nucleic acid probe(B)

3 基于免標記核酸探針的汞離子傳感器

免標記核酸探針自開發以來在眾多檢測領域中得到了廣泛研究，基于免標記核酸探針的汞離子生物傳感器主要依賴富含胸腺嘧啶的DNA寡核苷酸鏈在構象上的變化，包括雜交雙鏈的形成、雙鏈在體系中濃度或空間位置的變化等，在無需熒光基團標記的情況下實現隨汞離子濃度變化而發生熒光強度變化或其他信號的開啟或關閉[37]。該類型的檢測方法常用到等溫擴增、核酸外切酶Ⅲ(Exo Ⅲ)剪切等技術作為信號輔助放大系統以進一步提高檢測能力。

Zhu等[38]基于T-Hg(Ⅱ)-T和乳液PCR技術(ePCR)開發了一種汞離子的檢測方法，該方法以等溫擴增、ePCR和液滴讀取分析3個步驟，通過汞離子介導的等溫擴增實現核酸序列的延伸，再通過乳液PCR技術得到帶有正序列和負序列的液滴，由于檢測前已確定由5個T-Hg(Ⅱ)-T結構為基礎作為最佳擴增單位，因此可通過對擴增后正負液滴的比率分析實現汞離子的微量檢測。通過汞離子介導的核酸空間結構發生變化并形成DNA模擬酶復合物，可催化某些介體物質產生顏色變化。Du等基于T-Hg(Ⅱ)-T[39]和G-四鏈體[40]的免標記核酸探針，利用汞離子和DNA聚合酶的作用促進富G序列從原有模板序列上釋放，在合適條件下形成G-四鏈體并與氯高鐵血紅素結合形成具有過氧化物模擬酶活性的復合物。該復合物可催化ABTS產生肉眼可見的顏色變化進行汞離子的檢測。Yun等[41]同樣設計了此類汞離子探針，T-Hg(Ⅱ)-T配位化學誘導的熵驅動催化反應將富G序列從初始模板鏈上釋放，在氯高鐵血紅素參與下形成DNA模擬酶(DNAzyme)并催化四甲基聯苯胺(TMB)由無色變為藍色，通過測定吸光度可得到與汞離子濃度的線性關系。但可視化檢測法雖然可直觀反映體系對目標檢測物的響應，卻仍需進一步定量分析，因此基于免標記核酸探針的熒光檢測法被不斷開發。Song等[42]設計了基于T-Hg(Ⅱ)-T和黃連素的無標記核酸探針(如圖4B)，當汞離子不存在時，黃連素在游離狀態下熒光強度極微弱，少量附著在寡核苷酸鏈上的黃連素的熒光強度小幅度增強；在汞離子存在時與寡核苷酸鏈形成發卡結構，為黃連素提供了穩定聚集位點，導致熒光強度大幅增強，基于此，可實現汞離子的檢測。Zhou等[43]設計了基于G-四鏈體的汞離子探針，該探針基于T-Hg(Ⅱ)-T結構的形成，導致伴隨生成的3′末端被Exo Ⅲ降解，并釋放被覆蓋的G4序列，在體系中自發形成G-四鏈體結構并發出熒光。Wang與Zhang等[ 44-45]則開發了基于T-Hg(Ⅱ)-T結構和G-四鏈體的“Turn-on”型汞離子敏感探針，該探針分別設計了寡核苷酸單鏈P1及互補鏈P2，P1鏈5′端含有G4序列，3′端含有多聚胸腺嘧啶堿基；汞離子的存在促使與P1互補配對的P2被替換，T-Hg(Ⅱ)-T結構的形成可導致G4序列被釋放并自發形成G-四鏈體，該結構在卟啉類化合物N-甲基-卟啉二丙酸Ⅸ(NMM)結合下產生熒光。此后，Liu與Ding等設計了基于G-四鏈體的“Turn-off”型汞離子探針[46-47]，該方法利用汞離子與多聚胸腺嘧啶寡核苷酸鏈結合形成的T-Hg(Ⅱ)-T結構覆蓋G4序列，從而阻止該序列形成G-四鏈體結構，與體系中dsDNA單獨存在導致的強烈熒光相比，汞離子的加入可猝滅熒光，同時在Exo Ⅲ作用下熒光強度進一步下降。該類型探針借助特殊發光性質的核酸染料或熒光基團，在無需標記情況下與核酸探針溶液體系簡單混合則可實現低成本的汞離子檢測。免標記核酸探針正成為汞離子生物傳感器研究的新方向。

表1為上述3類檢測方法所涉及文獻在檢測范圍、檢測限、有無信號放大途徑3項指標上的對比。

表1 3類檢測方法及其指標對比Table 1 Comparison of three detection methods and their indicators

(續表1)

Detection methodSignal probeSignal amplificationDetection range(nmol·L-1)Detection limit(nmol·L-1)ReferenceSilver nanoclustersAuNPsExonuclease Ⅲ5.0×10-3～102.3×10-3[32]Graphene oxideOND-CDs-5～2002.6[33]Thymine groupCdTe quantum dots-0～1003.33[34]ePCRPositive/ negative droplets-4×10-6～4×10-21×10-5[38]Peroxo mimetic enzymeABTS(2,2'-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)-20～50016.5[39]DNAzymeTetramethylbenzidine-5×10-3～20.1[41]Thymine groupBerberine-100～1×1047.7[42]G-quadruplexNMM(N-甲基-卟啉二丙酸Ⅸ)Exonuclease Ⅲ1×10-6～1001×10-5[43]G-quadruplexNMM-50～50012.9[44-45]G-quadruplexNMMExonuclease Ⅲ1×10-3～5001×10-3[46-47]

*no signal amplification

4 結論與展望

在汞等重金屬污染日益嚴重的背景下，近年來各類新型汞離子生物傳感器陸續被開發出來，相較于傳統汞離子檢測手段，新型汞離子生物傳感器在檢測水平與檢測效率上均有了較大的提高，利用這些方法不僅可以實現更為高效準確的汞檢測和污染預防，還可為更多其他金屬離子或污染物的檢測提供參考。隨著新型材料被陸續開發，今后以T-Hg(Ⅱ)-T為識別基團時可無需設計復雜的寡核苷酸鏈，而是以單胸腺嘧啶核苷酸為識別位點，在探針設計與制備過程中可更加靈活；同時汞離子的生物傳感器后續發展可基于信號放大技術(如等溫擴增技術、核酸外切酶輔助信號放大技術等)展開更多研究。當前汞離子傳感器的開發目標不僅是獲得更加高效準確的檢測方法，更是這類檢測方法在實際檢測領域發揮良好的經濟效應。因此，后續汞離子生物傳感器的設計需進一步考慮其實際應用的可行性與便利性，與傳統汞離子檢測方法形成不同檢測場景的互補，從而將當前具有較大應用前景的傳感器進一步開發為可投放的成熟產品。